Bei der Präparation von Plasmid-DNA aus dem Bakterium E. coli können die im Kapitel 5.1 beschriebenen Methoden der sogenannten Kochlyse und alkalischen Lyse unterschieden werden. Eine zentrale Frage bei durchgeführten Plasmidpräparationen war, ob es zwischen den beiden Methoden wesentliche Unterschiede gibt, die es rechtfertigen würden, die eine gegenüber der anderen im Schülerexperiment vorzuziehen. Maßgabe dabei war neben der isolierten Menge an Plasmid-DNA der materielle und zeitliche Aufwand der beiden Methoden.
Plasmide können nach der Methode der alkalischen Lyse und der Kochlyse nicht nur aus Bakterien gewonnen werden, die zuvor in einer Flüssignährlösung hochgewachsen sind, sondern auch aus direkt von Agarnährbodenplatten gepickten Bakterienkolonien, wo je nach Größe in etwa 10 Kolonien von der Platte entnommen werden (AGESEN et al. 1991). Der Vorteil bei der Isolation von Plasmid-DNA aus direkt von Agarnährbodenplatten gepickten Bakterienkolonien liegt darin, daß am Tag vor der eigentlichen Präparation keine Flüssigkultur angesetzt werden muß.
Vor dem Hintergrund der Versuchsoptimierung bezüglich des zeitlichen und materiellen Aufwandes wurde untersucht, ob man einzelne Versuchsschritte bzw. Reagenzien auslassen kann, ohne das Versuchsergebnis an isolierter Plasmidmenge entscheidend zu verschlechtern. Für beide Präparationsmethoden wurde versucht, eine optimale Ausgangsmenge an Bakterienzellen festzustellen. Der Einfluß von Lysozym auf die zu isolierende Plasmidmenge war ein Untersuchungspunkt bei der Kochlyse. Bei Plasmidpräparation mittels alkalischer Lyse sollten die Auswirkungen eines fehlenden Ethanolreinigungsschrittes auf die Menge an isolierter Plasmid-DNA, die Gelelektrophorese und Transformation ermittelt werden. Gleiches gilt für den Einsatz von RNase. Unter der Prämisse einer für die Folgeexperimente ausreichenden Plasmidausbeute wurde untersucht, in welchen Maße Zentrifugationszeiten verkürzt werden können.
Die verwendeten Materialien und Methoden entsprechen denen, die in den Lehrermanuals zur Plasmidpräparation Kapitel 5.1.1.1 und 5.1.2.1 angegeben sind. Die Mengenabschätzung isolierter Plasmid-DNA erfolgte nach der elektrophoretischen Auftrennung im Agarosegel anhand des Helligkeitsvergleiches zwischen den einzelnen Banden der Proben- und Standard-DNA. Als Standard-DNA wurde mit dem Restriktionsenzym HindIII geschnittene Lambda-DNA im Gel verwendet, die definierte DNA Konzentrationen in jeder Bande besitzt (Tab. 6).
Banden Nr. |
Größe (bp) |
DNA Konzentration in der Bande (µg) |
1 |
23130 |
0,48 |
2 |
9416 |
0,19 |
3 |
6557 |
0,14 |
4 |
4361 |
0,09 |
5 |
2322 |
0,05 |
6 |
2027 |
0,04 |
7 |
564 |
0,01 |
Für die Mengenabschätzung wurde nur die superhelikale Form des Plasmids berücksichtigt. Die Entscheidung fiel trotz der Kenntnis, daß nach HANAHAN (1983), neben der superhelikalen Form, 75% des in entspannter Konformation vorliegenden Plasmids transformationsfähig sind. Der Entschluß fiel aus zwei Gründen:
In mit Ethidiumbromid angefärbten Gelen waren zum einen nicht immer Banden zu sehen, bzw. die der entspannten Form des Plasmids hätten zweifelsfrei zugeordnet werden können. Zum anderen betrug der Anteil der Bande im Vergleich zur superhelikalen nur ca. 8%, was bezogen auf die 75%ige Transformationsfähigkeit etwa 6% ausmacht (Abb. 5).
In Gelen, die mit Methylenblau gefärbt wurden, war in der Regel nur eine Bande zu erkennen. Diese konnten der superhelikalen Form des Plasmids zugeordnet werden (Abb. 6). Da in Schulen wegen der in Kapitel 6.3 erläuterten Gründe auf Ethidumbromid zugunsten von Methylenblau verzichtet werden soll, werden Schüler Banden der anderen Formen des Plasmids auf ihren Gelen wahrscheinlich nicht sehen. Um aber eine Vergleichbarkeit mit den gewonnenen Ergebnissen herzustellen, wurde auf die Einrechnung des Anteils auf die Gesamtmenge an isolierter Plasmid-DNA verzichtet.
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