6.1.3 Ergebnisse

Abbildung 5: Ergebnis einer gelelektrophoretischen Auftrennung (0,8% Agarose) des Plasmids pUC 19 nach erfolgter Plasmidpräparation. Färbung des Gels mit Ethidiumbromid.
In die Geltaschen wurden folgende Proben gegegeben:
Spur 1: 10 µl einer alkalischen Plasmidpräparation aus 3 ml Übernachtkultur.
Spur 2: 20 µl einer alkalischen Plasmidpräparation von 10 auf einem Nährboden gewachsensen Kolonien.
Spur 3: 500 ng Marker-DNA Lambda/HindIII.
Spur 4: 10 µl einer Plasmidpräparation mittels Kochlyse aus 3 ml Übernachtkultur.
Spur 5: 20 µl einer Plasmidpräparation mittels Kochlyse von 10 auf einem Nährboden gewachsenen Kolonien.
Spur 6: 20 µl pUC 19 Plasmid-DNA mit bekannter Konzentration (5 ng/µl).

In Spur 1 der Abbildung 5 sind deutlich 4 Banden zu sehen und zwar im Bereich von 2, 3, 4 und 23 kb. In Spur 2 ist nur eine Bande im Bereich von 2 kb ersichtlich. Die Spur 4 enthält 3 Banden im Bereich von 2, 3 und 23 kb sowie eine langgezogene Zone im niedermolekularen Bereich. Eine Bande im Gebiet von 2 kb ist sowohl in Spur 5 als auch in 6 ersichtlich.
Setzt man die Helligkeitsunterschiede der Banden in Spur 1 in Relation zueinander, so entfallen auf die Bande im Bereich von 2 kb 80%, auf die Bande im 3 kb Bereich 8% und auf die Bande im Bereich 4 kb 5%. Die Bande mit 23 kb besitzt in etwa 10%.

Spur	Plasmid	Präparationsmethode	Kulturmedium	Ges.konz. Plasmid-DNA (ng/µl)
1	pUC 19	alkalische Lyse	Flüssigmedium	80
2	pUC 19	alkalische Lyse	Agarnährboden	2
4	pUC 19	Kochlyse	Flüssigmedium	72
5	pUC 19	Kochlyse	Agarnährboden	2
6	pUC 19	-	-	4,75

Tabelle 7: Ergebnisse der Mengenabschätzung an isolierter Plasmid-DNA aus Abbildung 5 anhand des Helligkeitsvergleiches mit den Banden der Marker-DNA.

Alle in den nachfolgenden Tabellen genannten Plasmidkonzentrationen beziehen sich auf ein Gesamtvolumen von 50 µl.
In diesen wurde die isolierte Plasmid-DNA nach der Plasmidpräparation resuspendiert.

	Präparationsmethode	Präparationsmethode
	alkalische Lyse	Kochlyse
Plasmid	Ges.konz. Plasmid-DNA (ng/µl)	Ges.konz. Plasmid-DNA (ng/µl)
pAmp	1	0
pAmp	3,5	0
pAmp	0	0
pUC 19	2	2

Tabelle 8: Ergebnisse einer Plasmidpräparation aus direkt vom Agarnährboden gepickten Kolonien.
(Bakterien wurden für die Plasmidpräparation von den gleichen Agarplatten gepickt).

	Präparationsmethode alkalische Lyse	Präparationsmethode Kochlyse
Plasmid	Ges.konz. Plasmid-DNA (ng/µl)	Ges.konz. Plasmid-DNA (ng/µl)
pUC 18	40	5
pUC 18	40	0
pAmp	4,5	3,5
pAmp	4,5	3,5
pAmp	7	1,25
pAmp	9	2,5
pUC 19	20	72

Tabelle 9: Ergebnisse einer Plasmidpräparation mit aus Flüssigmedium gewonnenen Bakterien.
(Bakterien wurden für die Kochlyse und alkalische Lyse aus den gleichen Übernachtkulturen gewonnen)

Plasmid	Präparationsmethode	Ausgangsvol. aus Übernachtkultur (ml)	Ges.konz. Plasmid-DNA (ng/µl)
pBR 322	alkalische Lyse	4	~ 60
pBR 322	alkalische Lyse	4	~ 60
pUC 18	alkalische Lyse	4	~ 10
pUC 18	alkalische Lyse	4	~ 30
pUC 18	Kochlyse	2	kein Nachweis
pUC 18	Kochlyse	2	kein Nachweis
pUC 18	alkalische Lyse	4	kein Nachweis
pUC 18	alkalische Lyse	4	~ 16
pUC 18	Kochlyse	2	kein Nachweis
pUC 18	Kochlyse	2	~ 1
pUC 18	alkalische Lyse	4	~ 80
pUC 18	alkalische Lyse	4	~ 80
pUC 18	Kochlyse	3	~ 5
pUC 18	Kochlyse	3	kein Nachweis
pAmp	alkalische Lyse	4	~ 4,5
pAmp	alkalische Lyse	3	~ 4,5
pAmp	Kochlyse	3	~ 3,5
pAmp	Kochlyse	3	~ 3,5
pAmp	alkalische Lyse	1,5	~ 7,0
pAmp	alkalische Lyse	3	~ 9,0
pAmp	Kochlyse	1,5	~ 1,25
pAmp	Kochlyse	3	~ 2,5
pUC 19	alkalische Lyse	3	~ 20
pUC 19	Kochlyse	3	~ 72

Tabelle 10: Ergebnisse der Plasmidpräparationen von aus einer Flüssigübernachtkultur gewonnenen Bakterienzellen.

Plasmid	Präparationsmethode	Kolonienzahl	Ges.konz. Plasmid-DNA (ng/µl)
pBR 322	Kochlyse	1 (mittelgroß)	kein Nachweis
pBR 322	Kochlyse	1 (mittelgroß)	kein Nachweis
pBR 322	Kochlyse	4 (mittelgroß)	~ 2
pBR 322	Kochlyse	4 (mittelgroß)	~ 1
pBR 322	Kochlyse	4 (mittelgroß)	< 1
pBR 322	Kochlyse	4 (mittelgroß)	< 1
pUC 18	alkalische Lyse	50 (klein)	< 1
pUC 18	Kochlyse	40 (klein)	kein Nachweis
pAmp	alkalische Lyse	5 (große)	< 1
pAmp	alkalische Lyse	5 (große)	~ 3,5
pAmp	Kochlyse	5 (große)	kein Nachweis
pAmp	Kochlyse	5 (große)	kein Nachweis
pAmp	alkalische Lyse	5 (große)	kein Nachweis
pAmp	Kochlyse	5 (große)	kein Nachweis
pUC 19	alkalische Lyse	10 (mittelgroß)	~ 2
pUC 19	Kochlyse	10 (mittelgroß)	~ 2

Tabelle 11: Ergebnisse der Plasmidpräparationen aus direkt von Agarnährböden gepickten Kolonien.

	Lysozym (+)	Lysozym (-)
Plasmid/ Kulturmedium	Ges.konz. Plasmid-DNA (ng/µl)	Ges.konz. Plasmid-DNA (ng/µl)
pBR 322/ Flüssigmedium	4	2
pBR 322/ Flüssigmedium	15	2,5
pBR 322/ Flüssigmedium	5	1
pBR 322/ Agarnährboden	2	1
pBR 322/ Agarnährboden	1	1

Tabelle 12: Ergebnisse von Plasmidpräparationen mittels Kochlyse mit und ohne Lysozymzugabe.

Plasmid	Ethanolreinigung	Kulturmedium	Ges.konz. Plasmid-DNA (ng/µl)
pUC 18	ja	Flüssigmedium	~ 40
pUC 18	ja	Flüssigmedium	~ 40
pUC 18	nein	Flüssigmedium	~ 40
pUC 18	nein	Flüssigmedium	~ 40

Tabelle 13: Ergebnisse einer Plasmidpräparation mittels Kochlyse ohne Ethanolreinigungsschritt

Plasmid	Präparationsmethode	Kulturmedium	Ges.konz. Plasmid-DNA (ng/µl)
pUC 18	alkalische Lyse	Flüssigmedium	~ 5
pUC 18	alkalische Lyse	Flüssigmedium	~ 5

Tabelle 14: Ergebnisse einer Plasmidpräparation mittels Kochlyse ohne RNase-Zugabe.

Ansatz

Plasmid

Plasmidpräp.

Plasmidmenge

ng

µl

Verdünnung

Kolonien ges.

Kolonien/µg Plasmid

1-1

pUC 18

ohne RNase

unverdünnt

~2240

2,3 x 10⁵

1-2

pUC 18

ohne RNase

1 zu 10

224

2,3 x 10⁵

2-1

pUC 18

ohne Ethanolr.

1,25

unverdünnt

~4300

4,3 x 10⁵

2-2

pUC 18

ohne Ethanolr.

1,25

1 zu 10

430

4,3 x 10⁵

Tabelle 15: Transformationsergebnisse nach Methode A (Kapitel 5.4.1) mit dem Plasmid pUC 18 ohne RNase-Behandlung bzw. Ethanolreinigungsschritt bei der Plasmidpräparation. Bei Ansatz 1-1 und 2-1 fand eine Abschätzung der Kolonienzahl anhand der jeweiligen Kolonienzahl der 1/10-Verdünnung statt.

Plasmid	Kulturmedium	Zentrifugationszeit (Min.)	Ges.konz. Plasmid-DNA (ng/µl)
pUC 18	Flüssigmedium	15	~ 40
pUC 18	Flüssigmedium	15	~ 40
pUC 18	Flüssigmedium	15	~ 40
pUC 18	Flüssigmedium	15	~ 40
pUC 18	Flüssigmedium	5	~ 1
pUC 18	Flüssigmedium	5	~ 4

Tabelle 16: Ergebnisse einer Plasmidpräparation mittels alkalischer Lyse in Abhängigkeit der Zentrifugationszeit.

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