5.3.2 Schülermanual zur Gelelektrophorese (als Word97-Dokument zum Download)

A. Sachinformation

Transformation ist definiert als „Übertragung gereinigter, auch rekombinanter DNA auf Zellen" (NEVERS et al. 1992, S. 149). Auf diese Weise können Genome gezielt verändert werden. Die definierte Neukombination von DNA über natürliche Artgrenzen hinweg, ist das wesentliche Element der Gentechnik.
Zunächst müssen die Bakterienzellen in einen Zustand überführt werden, der es ihnen ermöglicht, von außen zugeführte DNA (hier: Plasmid-DNA) in die Zelle aufzunehmen. In diesem Fall spricht man von kompetenten Zellen. Empirisch konnte festgestellt werden, daß durch die Zugabe von CaCl₂ die Zellen durchlässig für DNA gemacht werden können. Was sich dabei jedoch genau auf zellulärer Ebene abspielt, ist bis heute im Detail noch nicht geklärt. Es lassen sich grundsätzlich zwei Verfahren zur Gewinnung kompetenter Zellen nach der CaCl₂-Methode anwenden, die sich sowohl in der Art der Versuchsdurchführung, im Zeitaufwand, als auch in ihrem Versuchsergebnis unterscheiden.

Die Methode A geht von Bakterienkolonien aus, die auf einem Nährboden gewachsen sind und direkt, d.h. ohne vorherige Proliferation im flüssigem Nährmedium bei 37 °C, zur Gewinnung kompetenter Zellen herangezogen werden.
Die Methode B beschreibt den klassischen Weg der Herstellung kompetenter Zellen wie er auch noch heute in unterschiedlichen Variationen in Labors durchgeführt wird. Der Schritt der Transformation schließt sich dem der Herstellung kompetenter Zellen an. Bei dieser Methode muß allerdings ein erheblich höherer Zeitaufwand und eine speziellere Materialausstattung in Kauf genommen werden. Nach Literaturangaben (MICKLOS/ FREYER 1990) ist mit Methode B eine höhere Transformationsquote zu erzielen, als mit Methode A. Dieses konnte in eigenen Versuchen jedoch nicht bestätigt werden (Kapitel 6.4.4.1).

B. Vorbereitungen durch den Lehrer

a) Zusammenstellung der Versuchsmaterialien:

Bakterien: E. coli Stamm: K-12 DH5a

Plasmid: pBR322 od. pUC18 od. pUC19 od. pAMP

Geräte:
Wasserbad 42 °C
Brutschrank 37 °C
6 Petrischalen (steril)
5 Reaktionsgefäße (1,5 ml) (steril)
16 Pipettenspitzen (steril)
1 Mikropipettierhilfe od. Alternative
1 Impföse
1 Drigalskispatel
1 Bunsenbrenner
1 Eimer bzw. Styroporbehälter mit feingehacktem Eis oder Eisbad
1 Eimer mit Desinfektionsmittel
1 Becher mit autoklavierbarem Beutel für Abfälle
1 Filzstift (wasserfest)
Parafilmâ oder Isolierband
1 Ständer für Reaktionsgefäße (kann aus Styropor selbst gebaut werden)

Chemikalien, Nährmedien u. Lösungen:
2 LB-Nährböden (steril)
4 LB-Nährböden mit Ampicillin (50 mg/ml) (steril)
CaCl₂ (50 mM) (steril)
LB-Medium (steril)
Ethanol

b) Ansetzen der Lösungen:

Kalziumchlorid-Lösung (CaCl₂) (50 mM) (steril):
Für 100 ml: 0,55 g CaCl₂ sind in 100 ml destilliertem Wasser zu lösen und anschließend zu autoklavieren (20 Minuten, 121 °C, 1 bar).

Lagerung: Bei Raumtemperatur für mehrere Monate verwendbar.

LB-Medium:
10 g Trypton (Caseinhydrolysat),
5 g Hefeextrakt,
10 g NaCl

werden mit 1 l destilliertem Wasser aufgefüllt, mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt und autoklaviert (20 Min., 121 °C, 1 bar).

Lagerung: Nach dem Autoklavieren bei Raumtemperatur. Haltbar für mehrere Monate.

Gefahrstoffe und Entsorgung:

- NaOH (Natronlauge, wasserfrei):
R35: Verursacht schwere Verätzungen.
Entsorgung: Neutralisieren, in den Ausguß geben.

Für eine Vorratslösung von 15 ml werden 150 mg des Ampicillinpulvers in ein steriles und verschließbares Gefäß gegeben und mit 15 ml destilliertem Wasser (steril) gelöst.

Lagerung: Eingefroren fast unbegrenzt haltbar. Die Lösung kann auch im Kühl-schrank für 1-2 Monate gelagert werden.

Entsorgung: Sammelgefäß 1 (Organische Lösungsmittel - halogenfrei).

c) Gießen der Agarplatten:

15 g Agar werden in einen 2 l Erlenmeyerkolben (oder in ein vergleichbares Gefäß) gegeben. Danach gießt man 1 l LB-Medium dazu. Das Gefäß wird mit Alu-Folie verschlossen und autoklaviert (20 Minuten, 121 °C, 1 bar). Wenn sich der Erlenmeyerkolben nach dem Autoklavieren auf ca. 60 °C abgekühlt hat, kann man den Agar in die Platten gießen und fest werden lassen. Damit der Agar richtig fest werden kann, sollten die Platten mindestens einen Tag vor ihrem Gebrauch gegossen werden. Aus 1 l erzielt man in etwa 40 Platten.

Lagerung: Die Agarplatten können auf dem Kopf stehend etwa 2-3 Wochen im Kühlschrank gelagert werden.

Im wesentlichen verläuft die Herstellung wie bei den LB-Agarplatten beschrieben. Lediglich vor dem Gießen der Platten werden dem etwa 60 °C warmen Agar 5 ml der Ampicillinstammlösung (10 mg/ml) zugegeben. Danach sind die Platten wie oben beschrieben zu gießen. Die Ampicillinkonzentration in den Platten beträgt
50 µg/ml.

Lagerung: Die Agarplatten können auf dem Kopf stehend etwa 2-3 Wochen im Kühlschrank gelagert werden.

Entsorgung: Ampicillin ist hitzeinstabil, d.h. benutzte LB-Agarplatten können nachdem ohnehin erforderlichen Autoklavierschritt im Hausmüll entsorgt werden.

Gefahrstoffe:
® siehe Einzelrezepte;
® Ampicillin kein Gefahrstoff i. S. der Gefahrstoffverordnung (GefStoffV),
Schüler sind aber in jedem Fall nach bekannten Allergien gegenüber
Penicillinen zu befragen. Die Schüler mit bekannter Allergie sollten es vorsorglich vermeiden, mit ampicillinhaltigen Materialien in Kontakt zu kommen.

Entsorgung:
a) gebrauchte Reaktionsgefäße, Pipettenspitzen und LB-Agarplatten (mit und ohne Ampicillin) im autoklavierbaren Beutel sammeln und autoklavieren.
b) Lösungen: ® können bis auf Ampicillinstammlösung in den Ausguß gegeben werden,
Ampicillinstammlösung in Sammelgefäß 1 (Organische Abfälle - halogenfrei).

Bezugsquellen für die Materialien ® siehe Materialliste (Kapitel 3).

Sterilität bei Pipettenspitzen und Reaktionsgefäßen ist auch gegeben, wenn sie direkt mit einem sauberen Gummihandschuh der industriellen Transportverpackung entnommen werden (Kapitel 6.6).

Alternative Pipettierhilfe ® Kapitel 6.8.

C. Versuchsdurchführung (72 - 82 Minuten)

Eine Einzelkolonie von einer Agarplatte mit E. coli wird mit einem sterilen Glasstab (Sterilität wird auch erreicht, wenn man den Glasstab kurz in Ethanol eintaucht und das Ethanol dann über der Flamme eines Bunsenbrenners abflämmt) aufgenommen, auf einer LB-Agarplatte ausplattiert und für 12 - 24 Stunden bei 37 °C inkubiert.

2 Reaktionsgefäße werden mit der Aufschrift "+Plasmid" und "- Plasmid" versehen.

In die Reaktionsgefäße werden jeweils 250 µl eiskaltes CaCl₂ pipettiert und auf Eis gestellt.

In jedes Reaktionsgefäß gibt man 1-2 Kolonien (Æ 3 mm) von den bebrüteten Platten hinzu. Die Kolonien werden dazu von dem Nährboden mit Hilfe einer zuvor in der Flamme eines Bunsenbrenner sterilisierten Impföse vorsichtig abgetragen und im CaCl₂ der Reaktionsgefäße suspendiert. ACHTUNG: Es darf sich kein Agar an der Öse befinden, da ansonsten durch die Verunreinigung die Effizienz der Transformation beeinträchtigt werden kann.

Beide Reaktionsgefäße werden für 5-15 Min. auf Eis inkubiert.

Zugabe von 50 ng Plasmid-DNA in das Reaktionsgefäß mit der Aufschrift "+Plasmid" (Angabe MICKLOS/ FREYER 1990).

Für weitere 15 Min. inkubiert man beide Reaktionsgefäße auf Eis.

Hitzeschock: Beide Reaktionsgefäße werden für 90 s in ein 42 °C warmes Wasserbad gestellt.

Danach erfolgt für 1 Min. ein Abkühlen auf Eis.

Nach der Minute werden die Reaktionsgefäße in einen Ständer gestellt. Bei Raumtemperatur gibt man 250 µl LB-Medium hinzu.

Ausprägung: Für ca. 30 Min. läßt man die Reaktionsgefäße bei Raumtemperatur oder in einem 37 °C warmen Wasserbad stehen, wobei man gelegentlich vorsichtig schüttelt.

Ausplattieren von jeweils 100 µl auf bereits vorbereiteten ampicillinhaltigen
(50 µg/ml) Agarplatten: Aus den zwei Reaktionsgefäßen („+Plasmid" und
„-Plasmid") werden jeweils 100 µl unverdünnt ausplattiert. 100 µl einer 1/10 Verdünnung werden auf der 3. und 4. Agarplatte ausgestrichen. Für die Verdünnung werden aus jedem Reaktionsgefäß 100 µl entnommen und verdünnt mit LB-Medium im Verhältnis 1/10. Auf die 5. Platte werden 100 µl aus dem Reaktionsgefäß mit der Aufschrift "- Plasmid" auf der Platte ausplattiert. Diese dient als Kontrolle dafür, ob die verwendeten E. coli-Zellen nicht auch ohne Plasmid ampicillinresistent sind. Für die Kontrolle der Kompetenz der Bakterienzellen werden 100 µl aus dem Reaktionsgefäß mit der Aufschrift "- Plasmid" auf einen LB-Nährboden ohne Ampicillinzusatz ausgestrichen. Alle Platten müssen entsprechend beschriftet werden.

Die Agarplatten werden auf dem Kopf stehend für 12 - 24 h in einem Brutschrank bei 37 °C inkubiert.

Der berechnete Zeitrahmen von 72 - 82 Min. für die Durchführung des Versuches bezieht sich auf die Versuchsschritte 2 - 13. Das unter 1. geplante Ausplattieren der E. coli Kolonie auf einer frischen LB-Agarplatte ist in der Regel am Vortag auszuführen, wobei man nicht länger als 10 Min. dafür benötigt. Diese Arbeiten können vom Lehrer oder aber auch von einigen Schülern erledigt werden. Es ist jedoch auch möglich die Platten einige Tage vor Versuchsbeginn auszuplattieren. Dann sollten diese aber nach spätestens 24 h aus dem Brutschrank entnommen und bei Raumtemperatur bis zum Versuchsbeginn gehalten werden.

zu 1. + 13.: Falls kein Brutschrank vorhanden sein sollte, können die Agarplatten auch bei Raumtemperatur gehalten werden. Allerdings ist die längere Inkubationszeit bis zur Auswertung zu berücksichtigen (Kapitel 6.7).

zu 11.: Ausprägungsphase ist nach eigenen Erfahrungen nicht zwingend nötig (Kapitel 6.4.4.2).

Die Nährbodenplatten sind immer auf dem Kopf stehend zu inkubieren. Das verhindert, daß durch das Kondenswasser die Kolonien auf der gesamten
Agarplatte verteilt werden und einen Bakterienrasen bilden.

Pipettieren: Beim Pipettieren ist darauf hinzuweisen, daß die Flüssigkeit am Boden des Reaktionsgefäßes abgesetzt wird und sich keine Tropfen an der Wand befinden. Dadurch wird ein optimales Mischungsverhältnis erreicht. Notfalls sollten die Reaktionsgefäße anzentrifugiert werden.

Beim Pipettieren und bei der Handhabung biologischer Materialien sollten grundsätzlich Gummihandschuhe getragen werden.

D. Auswertung (1-2 Schulstunden)

Die Agarplatten könnten zunächst einmal dahingehend beurteilt werden, ob die vorab formulierten Erwartungen eingetroffen sind. Dabei gilt es insbesondere auch die Kontrollen zu beurteilen.
Mögliche Leitfragen für die Auswertung könnten folgende sein:

Sind auf den Agarplatten Kolonien zu sehen? Entspricht das Auftreten den Erwartungen?

Zeigen diese Kolonien ein morphologisch einheitliches Aussehen? Wenn nicht, wieviel unterschiedliche Kolonientypen sind zu sehen und wie ist ihr morphologisches Erscheinungsbild? Welche möglichen Gründe gibt es für das Auftreten mehrerer unterschiedlicher Kolonieformen?

Entsprechen die Kontrollen den Erwartungen? Wenn nicht, welche möglichen Gründe kann das haben? Welche Konsequenzen müssen für die Beurteilung der übrigen Versuchsplatten getroffen werden?

Im Anschluß daran kann die Transformationsrate berechnet werden. Dabei setzt man die Anzahl der transformierten Zellen in Relation zur eingesetzten
Plasmid-Menge pro Versuchsansatz.
Für die Auszählung der Transformanten wählt man eine gut auszuzählende Agarplatte, d.h. eine Platte auf der die Anzahl der Kolonien überschaubar ist, so daß die Möglichkeit sich zu verzählen minimiert ist. In der Regel handelt es sich bei der auszuzählenden Agarplatte um die 1/10 Verdünnung des Versuchsansatzes. Nach erfolgter Auszählung vergleicht man das Ergebnis mit der anderen Agarplatte des Versuchsansatzes. Es wird abgeschätzt, ob das Ergebnis in etwa den Verdünnungsfaktor widerspiegelt.
Das Verhältnis von Transformanten pro mg Plasmid soll am folgenden Beispiel dargestellt werden:

Einem Reaktionsgefäß mit 250 µl CaCl₂ und E. coli-Zellen wurden 10 µl einer Plasmidkonzentration von 5 ng/ µl beigegeben. Später wurden dem Reaktionsgefäß 250 µl LB-Medium beigegeben. Aus einer 1/ 10 Verdünnung des Versuchsansatzes wurden auf einer Agarplatte 100 µl ausplattiert. Auf der Platte konnten nach der Inkubation 100 Kolonien gezählt werden.

(a) Berechnung der Konzentration der Plasmid-DNA im Versuchsansatz:
c_DNA = DNA : Gesamtvolumen des Versuchsansatzes
Þ c_DNA = 50 ng : 0,51 ml = 98,04 ng/ ml

(b) Konzentration der Plasmid-DNA in der 1/ 10 Verdünnung:
Þ c_DNA (1/10) = c_DNA : 10
Û c_DNA (1/10) = 98,04 : 10 = 9,80 ng/ ml

(c) Konzentration der Plasmid-DNA auf der Agarplatte:
Þ c_DNA Agarplatte = c_DNA (1/10) : 10
Û c_DNA Agarplatte = 9,80 : 10 = 0,98 ng/ Agarplatte

(d) Berechnung der Transformationsrate pro ng Plasmid-DNA:
Þ Anzahl der Kolonien/ Agarplatte : c_DNA Agarplatte
Û 100 Kolonien : 0,98 ng = 102 Kolonien/ ng

(e) Berechnung der Transformationsrate pro m g Plasmid-DNA:
Þ Anzahl der Kolonien/ ng · 1000
Û 102 · 1000 = 1,0 x 10⁵ Kolonien/ m g Plasmid-DNA

Im Beispiel konnten mit 1 µg Plasmid-DNA 1,0 x 10⁵ E. coli-Zellen transformiert werden.

Die Transformationsrate läßt Aussagen über die Effizienz der Transformation zu. Diese wiederum kann von vielen Faktoren abhängen, wie z.B. vom Zustand der kompetenten Zellen, da die Behandlung mit Kalziumchlorid für die Bakterien Streß bedeutet.
Die Transformationsraten der einzelnen Gruppen können gesammelt und hinsichtlich der Unterschiede im Plenum diskutiert werden, wobei mögliche Ursachen auf ihre Wahrscheinlichkeit von den Schülern kritisch beleuchtet werden sollten.

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