SCHÜLERMANUAL ZUM SCHÜLEREXPERIMENTTransformation von E. coli-Zellen mit Plasmid-DNA (Nährboden)A. SachinformationTransformation ist definiert als Übertragung gereinigter, auch rekombinanter DNA auf Zellen. Auf diese Weise können Genome gezielt verändert werden. Die definierte Neukombination von DNA über natürliche Artgrenzen hinweg, ist das wesentliche Element der Gentechnik. B. Material und GeräteBakterien: E. coli Stamm: K-12 DH5a Geräte: Chemikalien, Nährmedien u. Lösungen: C. Versuchsdurchführung
D. Auswertung
Volkmar Menz 9/1996 |
(siehe Lehrermanual zum Schülerexperiment nach Methode A, Kapitel 5.4.1)
B. Vorbereitungen durch den Lehrer
a) Zusammenstellung der Versuchsmaterialien:
Bakterien: E. coli Stamm: K-12 DH5a
Plasmid: pBR322 od. pUC18 od. pUC19 od. pAmp
Geräte:
Photometer
regelbares Wasserbad (37 °C + 42 °C) mit Schütteleinrichtung
Tischzentrifuge (mind. 2000 rpm, besser 10000 rpm)
Brutschrank (37 °C)
5 Petrischalen (steril)
4 Küvetten zur Absorptionsmessung
2 Reagenzgläser (steril)
5 Reaktionsgefäße (1,5 ml) (steril)
1 Pasteurpipette (steril)
7 Glaspipetten (2 ml) (steril)
14 Pipettenspitzen (steril)
1 Kolbenpipettierhilfe
1 Mikropipettierhilfe od. Alternative
1 Impföse
1 Drigalskispatel
1 Bunsenbrenner
1 Eimer bzw. Styroporbehälter mit feingehacktem Eis oder Eisbad
1 Eimer mit Desinfektionsmittel
1 Becher mit autoklavierbarem Beutel für Abfälle
1 Filzstift (wasserfest)
Parafilmâ oder Isolierband
1 Ständer für Reaktionsgefäße (kann aus Styropor selbst gebaut werden)
Chemikalien, Nährmedien u. Lösungen:
1 LB-Nährboden (steril)
4 LB-Nährböden mit Ampicillin (50 µg/ ml) (steril)
CaCl2-Lösung (50 mM) (steril)
LB-Medium (steril)
Ethanol
b) Ansetzen der Lösungen:
Kalziumchlorid-Lösung (CaCl2) (50 mM) (steril):
Für 100 ml: 0,55 g CaCl2 sind in 100 ml destilliertem Wasser zu lösen und anschließend zu autoklavieren (20 Minuten, 121 °C, 1 bar).
Lagerung: Bei Raumtemperatur für mehrere Monate.
LB-Medium:
10 g Trypton (Caseinhydrolysat),
5 g Hefeextrakt,
10 g NaCl
werden mit 1 l destilliertem Wasser aufgefüllt, mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt und autoklaviert (20 Min., 121 °C, 1 bar).
Lagerung: Nach dem Autoklavieren bei Raumtemperatur. Haltbar für mehrere Monate.
Gefahrstoffe und Entsorgung:
- NaOH (Natronlauge, wasserfrei):
R35: Verursacht schwere Verätzungen.
Entsorgung: Neutralisieren, in den Ausguß geben.
Ampicillin-Stammlösung:
Für eine Vorratslösung von 15 ml werden 150 mg des Ampicillinpulvers in ein steriles und verschließbares Gefäß gegeben und mit 15 ml sterilem destilliertem Wasser gelöst.
Lagerung: Eingefroren fast unbegrenzt haltbar. Die Lösung kann auch im Kühlschrank für 1-2 Monate gelagert werden.
Entsorgung: Sammelgefäß 1 (Organische Lösungsmittel - halogenfrei).
ACHTUNG: Bei Personen mit bekannter Penicillinallergie kann der Kontakt mit dem
Ampicillinpulver und der Ampicillinstammlösung allergische Reaktionen hervorrufen. Um zu
vermeiden, daß Schüler mit dem Ampicillinpulver in Berührung kommen, sollte der Lehrer
nicht nur die Ampicillinstammlösung selbst herstellen, sondern diese auch später unter
Verwendung einer Pipettierhilfe dem
Agaransatz für die LB-Platten zugeben. Jeder direkte Kontakt mit dem Ampicillinpulver und
der Stammlösung sollte vermieden werden.
c) Gießen der Agarplatten:
LB-Agarplatten:
15 g Agar werden in einen 2 l Erlenmeyerkolben (oder in ein vergleichbares Gefäß) gegeben. Danach gießt man 1 l LB-Medium dazu. Das Gefäß wird mit Alu-Folie verschlossen und autoklaviert (20 Minuten, 121 °C, 1 bar). Wenn sich der Erlenmeyerkolben nach dem Autoklavieren auf ca. 60 °C abgekühlt hat, kann man den Agar in die Platten gießen und fest werden lassen. Damit der Agar richtig fest werden kann, sollten die Platten mindestens einen Tag vor ihrem Gebrauch gegossen werden. Aus 1 L erzielt man in etwa 25 Platten.
Lagerung: Die Agarplatten können auf dem Kopf stehend etwa 2-3 Wochen im Kühlschrank gelagert werden.
LB-Agarplatten mit dem Antibiotikum Ampicillin (50 mg/ml):
Im wesentlichen verläuft die Herstellung wie bei den LB-Agarplatten beschrieben.
Lediglich vor dem Gießen der Platten werden dem etwa 60 °C warmen Agar 5 ml einer
Ampicillinstammlösung (10 mg/ml) zugegeben. Danach sind die Platten wie oben beschrieben
zu gießen. Die Ampicillinkonzentration in den Platten beträgt
50 mg/ml.
Lagerung: Die Agarplatten können auf dem Kopf stehend etwa 2-3 Wochen im Kühlschrank gelagert werden.
Entsorgung: Ampicillin ist hitzeinstabil, d.h. benutzte LB-Agarplatten können nachdem ohnehin erforderlichen Autoklavierschritt im Hausmüll entsorgt werden.
Hinweise:
Gefahrstoffe:
® siehe Einzelrezepte;
® Ampicillin kein Gefahrstoff i. S. der Gefahrstoffverordnung (GefStoffV),
Schüler sind aber in jedem Fall nach bekannten Allergien gegenüber
Penicillinen zu befragen. Die Schüler mit bekannter Allergie sollten es vorsorglich vermeiden, mit ampicillinhaltigen Materialien in Kontakt zu kommen.Entsorgung:
a) gebrauchte Reaktionsgefäße, Pipettenspitzen und LB-Agarplatten (mit und ohne Ampicillin) im autoklavierbaren Beutel sammeln und autoklavieren.
b) Lösungen: ® können bis auf Ampicillinstammlösung in den Ausguß gegeben werden,
Ampicillinstammlösung in Sammelgefäß 1 (Organische Abfälle - halogenfrei).Bezugsquellen für die Materialien ® siehe Materialliste (Kapitel 3).
Sterilität bei Pipettenspitzen und Reaktionsgefäßen ist auch gegeben, wenn sie direkt mit einem sauberen Gummihandschuh der industriellen Transportverpackung entnommen werden (Kapitel 6.6).
Alternative Pipettierhilfe ® Kapitel 6.8.
Ansetzen der Übernachtkultur (10 Min.):
Eine Übernachtkultur der Bakterien wird am Vortag des Versuches angesetzt, indem 5 ml LB-Medium im Reagenzglas angeimpft und über Nacht bei 37 °C geschüttelt bzw. belüftet werden.
Herstellung kompetenter Zellen (140 - 260 Min.):
10 ml LB-Medium werden im Reagenzglas mit 0,1 ml der Übernachtkultur angeimpft und bei 37 °C geschüttelt bzw. belüftet bis der Extinktionswert 0,3-0,4 bei einer Wellenlänge von 550 nm beträgt (nach ca. 1,75 h).
Von den im LB-Medium hochgewachsenen Zellen werden aus ca. 9 ml Bakterienzellen gewonnen: 3x hintereinander werden in 2 Reaktionsgefäße jeweils 1,5 ml der Bakteriensuspension mit einer Glaspipette (2 ml) in die Reaktionsgefäße gegeben und abzentrifugiert (6000 rpm für 10 Min. (NEVERS o.J.); 10 Min. bei 2000 - 4000 rpm (MICKLOS/ FREYER 1990); 1 Min. bei 10000 rpm oder 5 Min. bei 6000 rpm (AGESEN et al. 1991)), wobei nach jedem Zentrifugationsschritt der Überstand in einen Eimer mit Desinfektionsmittel dekantiert wird.
Das zurückgebliebene Pellet der Reaktionsgefäße wird mit jeweils 1 ml eiskalter CaCl2-Lösung sorgfältig resuspendiert, z.B. indem vorsichtig die Flüssigkeit über das Pellet geschichtet und beides mit dem Finger aufgeschnippt wird oder mit einer Pasteurpipette oder einer anderen Pipettierhilfe inkl. Pipettenspitze durch Einsaugen und nachfolgendem langsamen Ablassen vermengt werden. Am Ende dürfen keine Zellklumpen mehr in der Suspension zu sehen sein.
Die Reaktionsgefäße werden dann für mindestens 20 Min. auf Eis gelagert.
Zentrifugation der auf Eis gelagerten und mit CaCl2-Lösung versehenen Bakterien für 5 Min. bei 2000 - 4000 rpm (MICKLOS/ FREYER 1990) bzw. 1 Min. bei 10000 rpm oder 5 Min. bei 6000 rpm (AGESEN et al. 1991).
Der Überstand wird vorsichtig in den Eimer mit Desinfektionsmittel dekantiert.
Das zurückgebliebene Pellet wird mit 0,2 ml eiskalter CaCl2-Lösung wie oben resuspendiert.
Vor der Weiterverwendung müssen die Zellen mindestens 40 - 120 Min. auf Eis stehen.
Transformation (ca. 55 - 85 Minuten):
Zugabe von 50 ng Plasmid-DNA (Angabe nach MICKLOS/ FREYER 1990) in eines der beiden Reaktionsgefäße, was dann mit der Aufschrift "+Plasmid" versehen wird. Das Reaktionsgefäß ohne Plasmid wird mit "- Plasmid" gekennzeichnet.
Beide Reaktionsgefäße werden für 10 - 40 Min. auf Eis gestellt.
Die beiden Gefäße werden dann für genau 90 s in einem Wasserbad bei 42 °C inkubiert.
Bei Raumtemperatur wird jedem Ansatz 1 ml LB-Medium hinzugefügt und vorsichtig geschüttelt.
Für 30 Min. werden die Ansätze dann in ein 37 °C warmes Wasserbad gestellt.
Ausplattieren von jeweils 100 µl auf bereits vorbereiteten ampicillinhaltigen
(50 m g/ml) Agarplatten: Aus den zwei Reaktionsgefäßen („+Plasmid" und
„-Plasmid") werden jeweils 100 µl unverdünnt ausplattiert. 100 µl einer 1/10 Verdünnung werden auf der 3. und 4. Agarplatte ausgestrichen. Für die Verdünnung werden aus jedem Reaktionsgefäß 100 µl entnommen und mit LB-Medium im Verhältnis 1/10 vermischt. Auf die 5. Platte werden 100 µl aus dem Reaktionsgefäß mit der Aufschrift "- Plasmid" auf der Platte ausplattiert. Diese dient als Kontrolle dafür, ob die verwendeten E. coli-Zellen nicht auch ohne Plasmid ampicillinresistent sind. Für die Kontrolle der Kompetenz der Bakterienzellen werden 100 µl aus dem Reaktionsgefäß mit der Aufschrift "- Plasmid" auf einen LB-Nährboden ohne Ampicillinzusatz ausgestrichen. Alle Platten müssen entsprechend beschriftet werden.Die Agarplatten werden auf dem Kopf stehend für 12 - 24 h in einem Brutschrank bei 37 °C inkubiert.
Hinweise:
Die Nährbodenplatten sind immer auf dem Kopf stehend zu inkubieren. Das verhindert, daß durch das Kondenswasser die Kolonien auf der gesamten
Agarplatte verteilt werden und einen Bakterienrasen bilden.Das Experiment kann nach der Herstellung kompetenter Zellen unterbrochen und in der nächsten Stunde fortgesetzt werden. Notwendig ist allerdings eine adäquate Lagerung der kompetenten Zellen:
Kurzfristige Aufbewahrung: In einem mit Eis gefüllten Behälter im Kühlschrank bei 10 °C für 24 h.
Langfristige Aufbewahrung: Zugabe von 0,25 ml kalter, steriler Glycerinlösung (ca. 80%) pro ml Zellen und einfrieren bei -20 °C.zu 5. (Transformation): Eine Ausprägungsphase ist nach eigenen Erfahrungen nicht zwingend nötig (Kapitel 6.4.4.2).
zu 7.(Transformation): Falls kein Brutschrank vorhanden sein sollte, können die Agarplatten auch bei Raumtemperatur gehalten werden. Allerdings ist die längere Inkubationszeit bis zur Auswertung zu berücksichtigen (Kapitel 6.4.4.2).
Pipettieren: Beim Pipettieren ist darauf hinzuweisen, daß die Flüssigkeit am Boden des Reaktionsgefäßes abgesetzt wird und sich keine Tropfen an der Wand befinden. Dadurch wird ein optimales Mischungsverhältnis erreicht. Notfalls sollten die Reaktionsgefäße anzentrifugiert werden.
Beim Pipettieren und bei der Handhabung biologischer Materialien sollten grundsätzlich Gummihandschuhe getragen werden.
Die Auswertung ist identisch mit der für Methode A angegebenen.
SCHÜLERMANUAL ZUM SCHÜLEREXPERIMENTTransformation von E. coli-Zellen mit Plasmid-DNA (Flüssigmedium)A. SachinformationTransformation ist definiert als Übertragung gereinigter, auch rekombinanter DNA auf Zellen. Auf diese Weise können Genome gezielt verändert werden. Die definierte Neukombination von DNA über natürliche Artgrenzen hinweg, ist das wesentliche Element der Gentechnik. B. Material und GeräteBakterien: E. coli Stamm: K-12 DH5a Plasmid: pBR322 od. pUC18 od. pUC19 od. pAmp Geräte: Chemikalien, Nährmedien u. Lösungen: C. VersuchsdurchführungAnsetzen einer Übernachtkultur:
Herstellung kompetenter Zellen:
Transformation:
D. Auswertung
Volkmar Menz 9/1996 |
Das Experiment ist in Verbindung mit dem unter Kapitel 5.4 angegebenen Schülerexperiment zur Transformation zu sehen.
Auf speziellen Agarplatten kann bei einigen Plasmiden die Identifizierung von
transformierten E. coli-Zellen anhand der Färbung dieser Kolonien erfolgen. Die
Färbung beruht auf einem pH-Wert abhängigen Farbumschlag eines Indikators im Zuge einer
metabolischen Substratverwertung der Bakterienzelle. Das Substrat ist Laktose, ein
Disaccharid in b -1,4-glycosidischer Bindung, welches mit Hilfe
des Enzyms b -Galaktosidase von der Bakterienzelle in Glukose
und Galaktose gespalten wird. Glukose und Galaktose wird dann von den Zellen weiter
verstoffwechselt. Dabei sinkt der pH-Wert innerhalb der E. coli-Zelle, was durch
den Farbumschlag eines Indikators, welcher sich im Medium befindet, angezeigt wird. Bei
den Agarplatten handelt es sich um McConkey-Agarplatten. Diese enthalten unter anderem
Laktose und das als pH-Indikator fungierende Neutralrot (Umschlagsbereich pH < 6,8 rot und pH > 8,0 gelb). Die
laktosefermentierenden E. coli-Zellen färben sich auf McConkey-Agarplatten
tiefrot. Die E. coli-Zellen, die keine Laktose verwerten können sind weiß. Der E.
coli Stamm DH5a ist nicht in der Lage Laktose zu verwerten.
Er besitzt zwar auf seinem Hauptchromosom das lac-Operon und damit auch die für die b -Galaktosidase codierenden Sequenzen, jedoch können aufgrund einer
Mutation die aminoterminalen Aminosäuren 11 - 46 nicht synthetisiert werden. Die Folge
ist ein inaktives Protein.
Es gibt Plasmide, die die Information für die ersten 146 aminoterminalen Aminosäuren in
ihrer DNA codiert haben. Transformiert man E. coli DH5a
mit Plasmiden (z.B. pUC18 oder pUC19), die die Information für die als a -Peptid bezeichneten 146 aminoterminalen Aminosäuren tragen, so
sind erfolgreich transformierte E. coli-Zellen in der Lage Laktose zu verwerten.
Man spricht in dem Zusammenhang von a -Komplementation, da sich
das a -Peptid mit dem enzymatisch inaktiven Protein zu einem
enzymatisch aktiven Enzym rekonstituiert.
a) Zusammenstellung der Versuchsmaterialien:
® siehe Schüleranleitung zum Transformationsexperiment.
Zusätzlich pro Schülergruppe:
Geräte:
2 Petrischalen (steril)
2 Pipettenspitzen
Chemikalien, Nährmedien u. Lösungen:
2 McConkey-Nährböden mit Ampicillin (50 µg/ml) (steril)
b) Ansetzen der Lösung:
Ampicillin-Stammlösung (10 mg/ml):
Für eine Vorratslösung von 15 ml werden 150 mg des Ampicillinpulvers in ein steriles und verschließbares Gefäß gegeben und mit 15 ml sterilem destilliertem Wasser gelöst.
Lagerung: Eingefroren fast unbegrenzt haltbar. Die Lösung kann auch im Kühlschrank für 1-2 Monate gelagert werden.
Entsorgung: Sammelgefäß 1 (Organische Lösungsmittel - halogenfrei).
ACHTUNG: Bei Personen mit bekannter Penicillinallergie kann der Kontakt mit dem
Ampicillinpulver und der Ampicillinstammlösung allergische Reaktionen hervorrufen. Um zu
vermeiden, daß Schüler mit dem Ampicillinpulver in Berührung kommen, sollte der Lehrer
nicht nur die Ampicillinstammlösung selbst herstellen, sondern diese auch später unter
Verwendung einer Pipettierhilfe dem
Agaransatz für die LB-Platten zugeben. Jeder direkte Kontakt mit dem Ampicillinpulver und
der Stammlösung sollte vermieden werden.
c) Gießen der Agarplatten:
McConkey-Agarplatten mit dem Antibiotikum Ampicillin (50 mg/ml):
Die für die Herstellung von McConkey-Agarplatten benötigten Substanzen kann man als
Fertigtrockensubstanz kaufen. Die entsprechende Menge der Fertigtrockensubstanz muß dann
nach den Angaben des Herstellers in einen Erlenmeyerkolben gegeben, mit destilliertem
Wasser aufgefüllt, mit Alu-Folie verschlossen und autoklaviert (20 Minuten, 121 °C, 1
bar) werden. Gegebenenfalls muß man dem Medium noch Laktose hinzufügen. Dabei sind die
Angaben des Herstellers zu beachten.
Wenn sich der Erlenmeyerkolben nach dem Autoklavieren auf ca. 60 °C abgekühlt hat, kann
man den Agar in die Platten gießen und fest werden lassen. Vor dem Gießen der Platten
werden dem etwa 60 °C warmen Agar 5 ml einer Ampicillinstammlösung (10 mg/ml) zugegeben.
Die Ampicillinkonzentration in den Platten beträgt 50 mg/ml.
Damit der Agar richtig fest werden kann, sollten die Platten mindestens einen Tag vor
ihrem Gebrauch gegossen werden. Aus 500 ml erzielt man in etwa 20 Platten.
Lagerung: Die Agarplatten können auf dem Kopf stehend etwa 2-3 Wochen im Kühlschrank gelagert werden.
Entsorgung: Ampicillin ist hitzeinstabil, d.h. benutzte Agarplatten können nachdem ohnehin erforderlichen Autoklavierschritt im Hausmüll entsorgt werden.
Hinweise:
Gefahrstoffe:
® keine;
® Ampicillin kein Gefahrstoff i. S. der Gefahrstoffverordnung (GefStoffV),
Schüler sind aber in jedem Fall nach bekannten Allergien gegenüber
Penicillinen zu befragen. Die Schüler mit bekannter Allergie sollten es vorsorglich vermeiden, mit ampicillinhaltigen Materialien in Kontakt zu kommen.Entsorgung:
a) gebrauchte Reaktionsgefäße, Pipettenspitzen und McConkey-Agarplatten im autoklavierbaren Beutel sammeln und autoklavieren.
b) Lösungen: ® können bis auf Ampicillinstammlösung in den Ausguß gegeben werden,
Ampicillinstammlösung in Sammelgefäß 1 (Organische Abfälle - halogenfrei).Bezugsquellen für die Materialien ® siehe Materialliste (Kapitel 3).
Sterilität bei Pipettenspitzen und Reaktionsgefäßen ist auch gegeben, wenn sie direkt mit einem sauberen Gummihandschuh der industriellen Transportverpackung entnommen werden (Kapitel 6.6).
Alternative Pipettierhilfe ® Kapitel 6.8.
Die Versuchsdurchführung fließt in die Versuchsdurchführung des Transformationsexperimentes (Kapitel 5.4) mit ein und stellt keinen erwähnenswerten Mehraufwand da. Der zeitliche Rahmen des Transformationsexperimentes wird in etwa um 10 Minuten verlängert.
Siehe auch Versuchdurchführung zur Transformation (Kapitel 5.4).
Von den mit dem Plasmid pUC18 ODER pUC19 transformierten Zellen werden 0,1 ml aus dem Reaktionsgefäß herausgenommen und auf einer McConkey-Agarplatte ausplattiert. Anschließend wird die Agarplatte beschriftet.
0,1 ml aus einer 1/10 Verdünnung mit LB-Medium von transformierten Zellen mit dem Plasmid pUC18 ODER pUC19 werden auf der McConkey-Agarplatte ausplattiert. Die Agarplatte wird nachfolgend beschriftet.
Beide Platten werden für 12 - 24 h bei 37 °C inkubiert.
Hinweise:
Wenn verschiedene Gruppen für die Transformation von E. coli unterschiedliche Plasmide (z.B. Gruppe 1 pUC19 und Gruppe 2 pBR322) benutzt haben, so können 0,1 ml der transformierten Zellen der Gruppe 1 und 2 in einer Verdünnung von 1/10 zusammen auf einer McConkey-Agarplatte ausplattiert werden. Man würde dann anhand der Koloniefärbung den deutlichen Unterschied zwischen mit pUC19 und pBR322 transformierten Zellen erkennen. Das Plasmid pBR322 besitzt nicht die Fähigkeit zur a -Komplementation, daher können die mit pBR322 transformierten Zellen die Laktose der McConkey-Platten nicht verwerten und sich dadurch auch nicht rot färben. Diese Kolonien sind weiß.
Die Auswertung der Platten sollte unmittelbar nach dem Beenden der Inkubation erfolgen, da laut MILLER (1992) die Farbreaktion nach einigen Tagen verblaßt. Beschleunigt wird dieser Prozeß durch die Einwirkung von Kälte, z.B. im Kühlschrank.
Beim Pipettieren und bei der Handhabung biologischer Materialien sollten grundsätzlich Gummihandschuhe getragen werden.
Die Auswertung ist im wesentlichen auf die Identifizierung der laktoseverwertenden Kolonien gerichtet. Dabei kann auf die genetischen Grundlagen vertiefend eingegangen werden. Als Stichwort ist das lac-Operon genannt.
Im Zusammenhang mit dem Einbau von Fremd-DNA in Plasmid-Vektoren wie pUC18 oder 19 kann anhand der Rot-Weiß-Färbung auf McConkey-Platten das Screenen von transformierten Zellen erläutert werden. Das Screenen oder Sichten dient der Identifizierung von Bakterienkolonien, die das Plasmid mit integrierter Fremd-DNA aufweisen. Die Bakterienzellen, die Plasmide mit intakter DNA-Sequenz für das a -Peptid tragen, sind in der Lage Laktose zu verwerten und werden deshalb auf entsprechenden McConkey-Platten rot gefärbt sein. Diese Bakterienkolonien sind von denen zu unterscheiden, die keine typische Rotfärbung aufweisen. Der Grund dafür liegt in der Integration der Fremd-DNA im Bereich des Genbereiches, der für das a -Peptid codiert. Dadurch wird die darin enthaltene Information zerstört und das Plasmid ist nicht mehr zur a -Komplementation fähig. Voraussetzung dafür ist ein Restriktionsenzym, das eine Schnittstelle in dem Genbereich auf dem Plasmid-Vektor besitzt.
SCHÜLERMANUAL ZUM SCHÜLEREXPERIMENTPhänotypenidentifizierung transformierter E. coli-Kolonien
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