5.1.2.2 Schülermanual zum Schülerexperiment (als Word97-Dokument zum Download)

A. Sachinformation

Die Entdeckung der Restriktionsenzyme stellt einen wesentlichen Grundstein für den Bereich der Molekulargenetik und damit auch für die Gentechnik dar. Ohne Restriktionsenzyme wäre die definierte Neukombination von Genen oder das Sequenzieren von Genen (Aufschlüsselung der DNA in ihre Nucleotidabfolge) unmöglich.
Der Begriff der Restriktion bezeichnet einen Vorgang, bei dem DNA enzymatisch zerlegt werden kann. Die für dieses Verfahren verwendeten Enzyme werden aus Bakterien isoliert und mit Bezeichnungen versehen, die Aufschluß über ihre Herkunft geben. Z.B. stammt das Restriktionsenzym EcoRI vom Bakterium E. coli, wofür das Kürzel "Eco" steht. Das "R" bezeichnet den Bakterienstamm und die römische Ziffer wird vergeben, wenn unterschiedliche Restriktionsenzyme eines Stammes bekannt sind. Eingeteilt werden Restriktionsenzyme nach ihrer Wirkungsweise in drei Klassen (Typen). Bei den im Schülerexperiment verwendeten Arten handelt es sich um Restriktionsenzyme vom Typ II. Das sind Endonucleasen, die palindromische Sequenzen aus 4 oder 6 Nucleotiden auf der zu schneidenden DNA erkennen und hydrolytisch die Phosphodiesterbindung zwischen zwei Nucleotiden auf beiden DNA-Strängen spalten. Die Enden besitzen hinsichtlich ihrer Struktur noch eine andere Besonderheit. Man unterscheidet sogenannte glatte und klebrige Enden. Glatte Enden liegen vor, wenn das Enzym einen einfachen doppelsträngigen Schnitt in der Mitte der Erkennungssequenz macht. Andere Restriktionsendonucleasen trennen die beiden DNA-Stränge um 2-4 Nucleotide versetzt zueinander, so daß die entstehenden DNA-Fragmente kurze einzelsträngige Überhänge an jedem Ende besitzen, sogenannte klebrige Enden. Auch Plasmid-DNA kann mit diesen Restriktionsenzymen gespalten werden. Voraussetzung ist, daß das verwendete Restriktionsenzym eine Erkennungsstelle in Form der oben angesprochenen Nucleotidsequenz auf dem Plasmid besitzt und ein passendes Methylierungsmuster aufweist. Man spricht von einer Restriktionsschnittstelle. Im Falle der ursprünglich zirkulär vorliegenden Plasmid-DNA führt die Spaltung beider DNA-Stränge mit einer Restriktionsendonuclease zu einem linearen DNA-Molekül. Für den Fall, daß auf dem Plasmid mehr als eine Restriktionsschnittstelle für diese Restriktionsendonuclease existiert, wird das Plasmid in mehrere Plasmidfragmente zerlegt. Prinzipiell kann man das herausgeschnittene DNA-Fragment auch wieder in das Plasmid einfügen. Dafür ist es von Vorteil, wenn durch die Restriktionsspaltung klebrige Enden entstanden sind, da die komplementären Basen der jeweiligen Enden selbständig zueinander finden und über Basenpaarungsenergie bereits schwache Bindungen eingehen. Unter Zuhilfenahme eines weiteren Enzyms, einer Ligase, können die Basenpaare stabil miteinander verknüpft werden. Glatte Enden haben durch ihre Struktur den Nachteil, daß ihre Enden keine freien Basen besitzen, wodurch eine Anbindung an ein anderes DNA-Fragment erschwert wird.
Soweit DNA der Träger der genetischen Information eines Organismus ist, können durch den Vorgang der Restriktion und Wiederverknüpfung DNA auch über natürliche Artgrenzen hinweg miteinander kombiniert werden.
Restriktionsnucleasen, dazu gehören neben den oben beschriebenen Endonucleasen auch sogenannte Exonucleasen, stellen zusammen mit DNA-Modifikations-enzymen bei Bakterien eine Art funktionelles Schutzsystem gegenüber artfremder DNA da. Allen Nucleasen ist gemein, daß sie in der Lage sind, DNA abzubauen. Lediglich ihre Angriffspunkte sind verschieden und finden in Bezeichnungen wie "endo" und "exo" ihre Spezifizierung hinsichtlich der Punkte, von denen aus sie DNA durch Spaltung der Phophodiesterverbindungen abbauen. Wird nun die Bakterienzelle mit artfremder DNA (z.B. Phagen-DNA) infiziert, so können Restriktionsendonucleasen diese DNA schneiden und dadurch für Restriktionsexonucleasen angreifbar machen.
Arteigene DNA besitzt die gleichen Erkennungssequenzen für die Restriktionsendonucleasen wie die artfremde. Warum wird die artfremde DNA abgebaut, wohingegen die arteigene vom Abbau verschont bleibt? Dabei spielt die Modifikation von DNA-Basen, die zu den Erkennungssequenzen der Restriktionsendonucleasen gehören, eine Rolle. Bewirkt wird die Modifikation von einer anderen Gruppe von Enzymen, die in der Lage sind, Cytosin- bzw. Adenosinbausteine der Nucleotiderkennungssequenzen zu methylieren. Die arteigene Restriktionsendonuklease erkennt zwar die Nucleotidsequenz, kann diese aufgrund der Methylierung aber nicht spalten.

B. Vorbereitungen durch den Lehrer

a) Zusammenstellung der Versuchsmaterialien:

Biologische Materialien:
Plasmid-DNA (z.B. aus Eigenpräparation)
Restriktionsenzyme (z.B. EcoRI und/ oder BamHI)

Geräte:
1 Wasserbad 37 °C oder Brutschrank 37 °C
1 Reaktionsgefäß (1,5 ml) (steril)
1 Pipettierhilfe (Mikropipettierhilfe oder Alternative)
4 Pipettenspitzen (steril)
1 Eimer mit autoklavierbarem Beutel für Abfälle
1 Ständer für Reaktionsgefäße (z.B. aus Styropor selbstgebastelt)
ggf. Kühlschrank (-20 °C)

Chemikalien und Lösungen:
Enzympufferlösung (wird v. Hersteller der Restriktionsenzyme mitgeliefert)

destilliertes H₂O (steril)

Gefahrstoffe: keine.

Entsorgung:
Gebrauchte Reaktionsgefäße und Pipettenspitzen im autoklavierbaren Beutel sammeln und autoklavieren.

Bezugsquellen für die Materialien siehe Kapitel 3.

Sterilität bei Pipettenspitzen und Reaktionsgefäßen ist auch gegeben, wenn sie direkt mit einem sauberen Gummihandschuh der industriellen Transportverpackung entnommen werden (Kapitel 6.6).

Alternative Pipettierhilfe ® siehe 6.8.

C. Versuchsdurchführung (ca. 50 - 65 Minuten)

Restriktionsansatz allgemein:
10 µl Plasmid-DNA
7 µl H₂O
2 µl 10 x Restriktionspuffer
1 µl Enzym

10 µl der Plasmidpräparation werden in ein neues Reaktionsgefäß gegeben.

Mit einer neuen Pipettenspitze werden 2 µl des Enzympuffers in das Reaktionsgefäß gegeben (Verhältnis Gesamtvolumen/ Puffer ® 1:10).

Zugabe von 7 µl destilliertem H₂O.

Zugabe von 1 µl des Restriktionsenzyms, Deckel fest verschließen (Verdunstungsschutz) und gut mischen.

Inkubation des Reaktionsgefäßes in einem Wasserbad bei 37 °C für 30-45 Min.

Danach erfolgt die gelelektrophoretische Auftrennung wie im Kapitel (5.3) zur Gelelektrophorese beschrieben.

Pipettieren: Beim Pipettieren ist darauf hinzuweisen, daß die Flüssigkeit am Boden des Reaktionsgefäßes abgesetzt wird und sich keine Tropfen an der Wand befinden. Dadurch wird ein optimales Mischungsverhältnis erreicht. Notfalls sollten die Reaktionsgefäße anzentrifugiert werden.

1 U (= Unit = Einheit) spaltet unter optimalen Bedingungen 1 µg DNA/ h. Ein Überschuß an Enzym verhindert eine unvollständige Spaltung und verkürzt die Inkubationszeit, 10facher Überschuß ist im Labor normal.

Beim Pipettieren von Lösungen und bei der Handhabung von biologischen Materialien sollten grundsätzlich Handschuhe getragen werden.

D. Auswertung

An die Restriktionsspaltung schließt sich die Gelelektrophorese mit nachfolgender Auswertung der Ergebnisse an.

Dem Reaktionsansatz muß vor dem Einfüllen in die Geltaschen lediglich noch 2 µl des Bromphenolprobenpuffers beigegeben werden.

Um den Vergleich zwischen gespaltener und ungespaltener Plasmid-DNA deutlich zu machen, sollte eine Spur des Geles eine Probe ungespaltener Plasmid-DNA enthalten.

Die Gelelektrophorese muß nicht am gleichen Tag erfolgen. Die gespaltene Plasmid-DNA kann bis zum folgenden Versuchstag im Eisfach des Kühlschranks eingefroren oder bei 4 °C gelagert werden. Das Einfrieren ist allerdings der normalen Lagerung vorzuziehen, da dadurch eine weitere Restriktion durch evtl. im Reaktionsansatz enthaltene unspezifische Nucleasen unterbunden wird.

 

5.2.2 Schülermanual zum Schülerexperiment (als Word97-Dokument zum Download)

A. Sachinformation

Die Gelelektrophorese stellt eine wesentliche Technik zur Analyse von DNA dar. Dabei macht man sich die Tatsache zunutze, daß DNA im elektrischen Feld aufgrund seiner negativen Ladung in einem definierten Puffer in Richtung Anode wandert. Kleine DNA-Fragmente wandern im Gel bestimmter Zusammensetzung schneller als große DNA-Fragmente. Für die Auftrennung von DNA-Fragmenten wird für das Gel sehr häufig das aus Agar gereinigte Biopolymer Agarose verwandt. Durch Färben mit spezifischen Farbstoffen kann die DNA nach dem Trennvorgang sichtbar gemacht werden, wobei die DNA in Form von Banden im Gel erscheint. Mit Hilfe sogenannter Marker-DNA kann man eine Eichkurve erstellen, anhand derer für die Proben-DNA eine relativ genaue Größenzuordnung getroffen werden kann. Bei der Marker-DNA handelt es sich um DNA definierter Größen- und Mengenzusammensetzung, die im Gel charakteristische Banden hinterläßt. Eine Helligkeitsabschätzung mit Banden der Marker-DNA erlaubt es darüber hinaus die in den Banden der Probe enthaltene DNA Menge abzuschätzen.

B. Vorbereitungen durch den Lehrer

a) Zusammenstellung der Versuchsmaterialien:

Biologische Materialien:
Marker-DNA (z.B. Lambda-DNA mit dem Restriktionsenzym HindIII geschnitten)
Proben-DNA (z.B. aus der Plasmidpräparation)

Geräte:
1 Gelkammer für 4 Geltaschen (Plastikbox, Kamm)
1 Netzgerät (Spielzeugeisenbahntransformator) od. Batterien (2 x 9V)
2 Elektroden (Bleistiftminen aus Graphit od. V2A-Stahl)
2 Krokodilklemmen
1 Becherglas (200 ml)
1 Heizplatte oder Mikrowelle oder Bunsenbrenner (inkl. Dreifuß mit Drahtnetz)
1 Kochtopf, ggf.
7 Pipettenspitzen
1 Mikropipettierhilfe od. Alternative
2 Reaktionsgefäße (1,5 ml)
1 Becher mit autoklavierbarem Beutel für Abfälle
1 Ständer für Reaktionsgefäße (kann aus Styropor selbst gebaut werden)
Haushaltsfolie

Chemikalien und Lösungen:
TBE-Puffer (1x konzentriert)
Agarose (0,8%)
Bromphenolblau-Probenpuffer
Methylenblau (0,025%)
destilliertes H₂O

b) Ansetzen der Lösungen:

TBE-Puffer (Tris-Borat-EDTA) (10x konzentriert):
10,899 g Tris-HCl
5,565 g H₃BO₃
0,935 g Na-EDTA
werden in 100 ml destilliertem H₂O gelöst.

Lagerung: Bei Raumtemperatur.

Gefahrstoffe und Entsorgung:

- EDTA (Ethylendinitrilotetraessigsäure):
R 22: Gesundheitsschädlich beim Verschlucken.
R 36/38: Reizt die Augen, reizt die Haut.
Entsorgung: Sammelgefäß 1 (Halogenfreie organische Lösungsmittel und Lösungen organischer Stoffe).

- HCl (Salzsäure):
R34: Verursacht Verätzungen.
R37: Reizt die Atmungsorgane.
Entsorgung: Neutralisieren, in den Ausguß geben.

- H₃BO₃ (Borsäure):
R34: Verursacht Verätzungen.
R37: Reizt die Atmungsorgane.
Entsorgung: Neutralisieren, in den Ausguß geben.

Þ Entsorgung TBE-Puffer: Sammelgefäß 1 (Organische Abfälle - halogenfrei).

50 ml TBE-Puffer 10x konzentriert werden zu 450 ml destilliertem H₂O gegeben.

Lagerung: Bei Raumtemperatur.

Gefahrstoffe und Entsorgung: ® s.o.

Bromphenolblau-Probenpuffer:
5 ml Glycerin 50%
40 ml destilliertes H₂O
5 ml TBE-Puffer (10x konzentriert)
100 mg Bromphenolblau

Lagerung: Im Kühlschrank bei 4 °C für Monate haltbar.

Gefahrstoffe und Entsorgung:

- TBE-Puffer:
® s.o.

- Bromphenolblau:
R 22: Gesundheitsschädlich beim Verschlucken.
R 36/38: Reizt die Augen, reizt die Haut.
Entsorgung: Sammelgefäß 2 (Organische Abfälle - halogenhaltig).

Þ Entsorgung Bromphenolblau-Probenpuffer:
Sammelgefäß 2 (Organische Abfälle - halogenhaltig).

Methylenblau (1%):
0,5 g Methylenblau werden in
50 ml destilliertem H₂O gelöst.

Lagerung: Bei Raumtemperatur in einem aus Braunglas bestehenden Gefäß.

Gefahrstoffe und Entsorgung:

-Methylenblau:
R 22: Gesundheitsschädlich beim Verschlucken.
Entsorgung: Sammelgefäß 1 (Halogenfreie organische Lösungsmittel und Lösungen organischer Stoffe).

Methylenblau (0,025%):
10 ml der Methylenblaulösung (1%) werden zu
390 ml destilliertem H₂O gegeben.

Lagerung: Bei Raumtemperatur in einem aus Braunglas bestehenden Gefäß.

Gefahrstoffe und Entsorgung: ® s.o.

Agarose-Gel (0,8%):
0,8 g Agarose werden zu
100 ml destilliertem H₂O gegeben und auf der Heizplatte im Wasserbad oder in der Mikrowelle durch Erhitzen gelöst.

Entsorgung: Natürliches Biopolymer, das biologisch abbaubar ist.

Gefahrstoffe:
® siehe Einzelrezepte.

Entsorgung:
a) gebrauchte Reaktionsgefäße und Pipettenspitzen im autoklavierbaren Beutel sammeln und autoklavieren.
b) Lösungen: ® siehe Einzelrezepte.

Bezugsquellen für die Materialien ® siehe Materialliste (Kapitel 3).

Sterilität bei Pipettenspitzen und Reaktionsgefäßen ist auch gegeben, wenn sie direkt mit einem sauberen Gummihandschuh der industriellen Transportverpackung entnommen werden (Kapitel 6.6).

Alternative Pipettierhilfe ® siehe Kapitel 6.8.

C. Versuchsdurchführung

Für die ersten beiden Arbeitsschritte des Versuches werden in etwa 50 Minuten benötigt. Daran schließt sich die DNA-Auftrennung an, die je nach angelegter Spannung zwischen 5 und 12 Stunden dauert. Die Färbung des Gels nach der DNA-Auftrennung ist mit ca. 36 Minuten veranschlagt.

0,8 g Agarose werden abgewogen und in ein Becherglas gegeben. Zu der Agarose werden nun 100 ml TBE-Puffer (1x konzentriert) zugegeben.

In einem Wasserbad wird der Agaroseansatz so lange gekocht, bis die Agarose sich vollständig aufgelöst hat und eine klare, schlierenfreie Flüssigkeit darstellt (ca. 5 Min.). Anstelle des Wasserbades kann auch eine Mikrowelle zum Auflösen der Agarose verwendet werden. Hier stellt der Agaroseansatz bereits nach ca. 1 Min. die klare und schlierenfreie Lösung dar; ACHTUNG: Verbrennungsgefahr durch Siedeverzug! Danach wird das Becherglas mit dem Gel zum Abkühlen auf den Tisch gestellt, wobei das durch das Erhitzen stark erwärmte Becherglas nur mit Kochlappen oder Geschirrtuch angefaßt werden sollte.

Zwischenzeitlich wird die Gelkammer vorbereitet: Der Kamm wird 0,5 - 1,0 cm entfernt von einer der beiden kurzen Kammerseiten so angebracht, daß er dort, wo die Geltaschen gebildet werden sollen, nicht an den Boden der Kammer gelangt.

Wenn sich die Agaroselösung auf ca. 60 °C abgekühlt hat, kann sie in die Gelkammer gegossen werden. Dabei ist auf eine gleichmäßige Verteilung des Gels zu achten. Die Höhe des Gels sollte in etwa 0,5 cm betragen. Ferner sollten eventuelle Luftblasen auf der Oberfläche des noch flüssigen Gels mit einem spitzen Gegenstand (z.B. Pipettenspitze) entfernt werden.

Nach ca. 10-15 Min. ist das Gel erstarrt. Nun kann man vorsichtig den Kamm herausziehen. Man muß darauf achten, daß die Taschen bzw. das Gel nicht zerreißen.

In jede Geltasche passen ca. 25 µl Flüssigkeit. Die eingesetzte Probenmenge sollte in etwa 22 µl betragen:

Die Gelkammer wird auf eine dunkle Unterlage gelegt und mit TBE-Puffer
(1x konzentriert) gefüllt bis der Puffer das Gel gut überdeckt.

In ein Reaktionsgefäß werden 20 µl destilliertes H₂O vorgelegt. Zugabe von
2 µg Marker-DNA (z.B. l HindIII). Danach werden 2 µl Blaumarker hinzugegeben Der Inhalt des Reaktionsgefäßes wird vorsichtig durch Schnippen des Reaktionsgefäßes gemischt.

20 µl der Proben-DNA, welche bei der Plasmidpräparation gewonnen wurde, werden in ein Reaktionsgefäß pipettiert, 2 µl Blaumarker zugesetzt und durch vorsichtiges Schnippen gemischt.

Erstellen eines Plans, in welche Geltasche welche DNA-Probe gegeben werden soll.

Die Marker-DNA vorsichtig in die erste Geltasche pipettieren. Durch das Glycerin im Blaumarker sinkt die Probe auf den Grund der Geltasche.

Die Proben-DNA wird ebenfalls in eine dafür vorgesehene Geltasche gegeben.

Die Krokodilklemmen werden an die vorgesehenen Graphitstäbe ODER den V2A-Stahl an den kurzen Seiten der Gelkammer angeschlossen und so mit den Batterien verbunden, daß die Kathode (Minuspol) sich auf der Seite der Geltaschen und die Anode (Pluspol) auf der gegenüberliegenden Seite befindet.
ACHTUNG: 25 Volt dürfen unter keinen Umständen überschritten werden, schwerwiegende körperliche Schäden oder Tod durch elektrischen Schlag!!!

Die Auftrennung der Proben ist dann abgeschlossen, wenn der Blaumarker das Ende des Gels erreicht hat. Bei einer Spannung von 18 V nach ca. 5-6 h und bei 9 V nach ca. 12 h. ACHTUNG: Wird die Spannung beibehalten, so kann die DNA über das Gelende hinauslaufen und dadurch verloren gehen.

Das Weiterlaufen des Gels wird durch entfernen der Krokodilklemmen unterbrochen. Der TBE-Puffer wird in ein Extragefäß gegossen und kann wiederverwendet werden.

Das Gel wird jetzt mit Methylenblau (0,025%) überschichtet.

Nach 15 Min. wird die Färbelösung in eine Extraflasche abgegossen (Färbelösung kann wiederverwendet werden). Das Gel wird mit kaltem Leitungswasser abgespült und anschließend für weitere 15 Min. mit kaltem Leitungswasser überschichtet. Dabei wird das Wasser ca. alle 5 Min. gewechselt. Die Banden sind nach 15 Min. zu erkennen.
ACHTUNG: Weiteres Entfärben des Gels kann eine Abschwächung der Intensität der DNA-Banden zur Folge haben.

Zur Aufbewahrung und späteren Auswertung kann das Gel in normale Haushaltsfolie verpackt und im Kühlschrank fast unbegrenzt gelagert werden. Die Haushaltsfolie verhindert dabei das Austrocknen des Gels.

Spannungsquelle: Gelelektrophorese-Apparatur darf keinesfalls mit mehr als 25 Volt betrieben werden. Schwerste körperliche Schäden oder der Tod könnten die Folge eines elektrischen Stromschlags sein! Bei Verwendung eines Spielzeugeisenbahntransformators sollte die maximal erreichbare Spannung vorher gemessen werden.

Pipettieren: Beim Pipettieren ist darauf hinzuweisen, daß die Flüssigkeit am Boden des Reaktionsgefäßes abgesetzt wird und sich keine Tropfen an der Wand befinden. Dadurch wird ein optimales Mischungsverhältnis erreicht. Notfalls sollten die Reaktionsgefäße anzentrifugiert werden.

Beim Färbevorgang sollten Handschuhe getragen werden, da Methylenblau nur schwer von der Haut abzubekommen ist.

Beim Pipettieren und bei der Handhabung biologischer Materialien sollten grundsätzlich Gummihandschuhe getragen werden.

D. Auswertung (1 - 2 Schulstunden)

Die Auswertung der Gele erfolgt zur besseren Beurteilung der DNA-Banden unter Weißlichtdurchleuchtung. Als Lichtquelle könnte das Licht eines Tageslichtprojektors dienen.

Für die Schüler wird es nicht schwierig sein die Größe der in den Banden enthaltenen DNA einzuordnen und eine Mengenabschätzung vorzunehmen. Um den methodischen Schritt der Größeneinschätzung von DNA vornehmen zu können, sollten die Schüler zuerst eine Eichkurve anhand der Marker-DNA erstellen, wobei auf halblogarithmischem Papier die DNA-Fragmentgröße in Basenpaaren (bp) im Verhältnis zur Entfernung von der Startstelle in cm aufgetragen wird. Dabei ist die Laufstrecke der DNA-Fragmente auf dem Gel dem Logarithmus der molaren Masse proportional. Die Fragmentgrößen der Marker-DNA können der Literatur oder der Beschreibung des Herstellers entnommen werden. Anhand der Eichkurve läßt sich nun auf die Größe der unbekannten Fragmente aus den Spuren mit Proben-DNA schließen. Die ermittelten Werte können dann mit Literaturangaben über die Größe der Plasmide verglichen werden. Um scheinbare Widersprüche zwischen Literaturangaben und selbst ermittelten Werten zur Plasmidgröße zu erklären, ist es sinnvoll, daß von Seiten des Lehrers auf die unterschiedlichen Zustandsformen der Plasmide eingegangen wird (superhelikal, entspannt, linear, Dimerformen).

In der Regel liegen Plasmide in Zellen in sogenannter superhelikaler Konformation vor, die aus Verdrillungen bzw. Überwindungen der ringförmig geschlossenen DNA-Doppelhelix resultieren. Im Laufe der Plasmidpräparation kann es zu einem Bruch („nick") in einem der beiden Stränge der Doppelhelix kommen. Dadurch entwindet sich die verdrillte DNA und nimmt eine Konformation ein, die als entspanntes Ringsystem bezeichnet wird. Kommt es zudem noch zu einem DNA-Bruch im anderen Einzelstrang, ist das Ringsystem aufgehoben und das Plasmid linearisiert. Dimer- oder Multimerformen entstehen bei Plasmiden im Zuge ihrer Replikation. Sie erklären sich aus der Verdopplung der Plasmid-DNA bei noch nicht erfolgter Trennung des replizierten Tochterplasmids. Im Agarosegel wandert die superhelikale Plasmid-DNA aufgrund ihrer Konformation am weitesten, gefolgt von der im entspannten Zustand vorliegenden Plasmid-DNA. Danach folgt die linearisierte Form des Plasmids. Diese Wanderungsstrecke korrespondiert mit der Größe des Plasmids in Basenpaaren wie sie in der Literatur angegeben ist. Dimer- und multimere Formen des Plasmids besitzen die größte Dichte der unterschiedlichen Plasmidkonformationen und legen im Agarosegel die geringste Strecke zurück. Die Erfahrung zeigt, daß Banden in den Proben der Schüler auftreten können, die sich mit den Erwartungen nicht decken. Es handelt sich dabei in der Regel um chromosomale DNA-Banden im hochmolekularen Bereich und um langgestreckte Banden, sogenannten "Schmier", im niedermolekularen Bereich, verursacht durch RNA- und kleine DNA-Fragmente.

Eine Mengenabschätzung der Plasmid-DNA in der Probe kann über einen Helligkeitsvergleich mit Banden der Marker-DNA erfolgen. Die DNA-Mengen der Marker-DNA sind der Literatur oder den Angaben des Herstellers zu entnehmen.

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