5.1.1.2 Schülermanual zum Schülerexperiment (als Word97-Dokument zum Download)

5.1.1.3 Schülermanual zum Schülerexperiment (als Word97-Dokument zum Download)

A. Sachinformation

Die alkalische Lyse grenzt sich im wesentlichen von der Kochlyse durch den Einsatz von Natriumhydroxid (NaOH) ab, das an die Stelle des Erhitzungschrittes tritt. Durch die Zugabe von NaOH zum Zellextrakt wird der
pH-Wert weit ins alkalische verschoben und befindet sich zwischen pH 12 und 12,5. Dadurch lösen sich die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären DNA-Strängen sowohl der chromosomalen als auch der Plasmid-DNA, wobei die Plasmid-DNA aufgrund ihrer Konformation in der Lage ist vollständig zu renaturieren. Im Gegensatz zur Plasmid-DNA kann die chromosomale DNA, die durch die einzelnen Präparationsschritte zerstückelt wurde, nach Neutralisation des pH-Wertes (pH 7,0) mit Kaliumacetat und Eisessig nicht mehr in dem Maße renaturieren, als daß in ihrer kompletten Basenabfolge komplementäre Stränge zueinander finden und Basenbindungen eingehen können. Vielmehr bilden sich DNA-Doppelstränge mit nur kurzen komplementären Bereichen aus. Hinzu kommt, daß dieser Prozeß nicht nur zwischen zwei DNA-Strängen stattfindet, sondern es durch die ungerichtete Verbindung vieler DNA-Einzelstränge zur Ausbildung einer verworrenen DNA-Masse kommt. Diese kann relativ leicht zusammen mit dem durch die Neutralisation ausgefallenem NaOH und SDS abzentrifugiert werden. Bei diesem Zentrifugationsschritt setzen sich ferner Zellmembran-, Zellwandbestandteile und Proteine in einem Pellet ab. Die Plasmid-DNA befindet sich nach der Zentrifugation im Überstand. Bevor jedoch der pH-Wert durch die Zugabe des NaOH ins alkalische verschoben wird, müssen die Bakterienzellen schon soweit behandelt sein, daß sowohl die Zellwand als auch die Cytoplasmamembran abgebaut bzw. lysiert und die Bestandteile des Cytosol, worin sich auch die Plasmide befinden, frei im Reaktionsgemisch vorliegen. Der Aufschluß der E. coli Zellen beginnt mit der Destabilisierung der dem Mureinsacculus aufgelagerten äußeren Membran durch Bindung von Kalziumionen mit Hilfe von EDTA. EDTA wird dem Versuchsansatz zusammen mit Tris-HCl und RNase beigegeben. Tris-HCl puffert das Medium, wohingegen das Enzym RNase RNA abbaut. Durch Zusatz der ionischen Detergens SDS (= Natriumdodecylsulfat) wird neben der Zerstörung des Mureinsacculuses, wobei SDS die mureinkettenverknüpfenden Peptidbindungen auflöst, auch die dadurch freigelegte Cytoplasmamembran lysiert.
Nach dem ersten Zentrifugationsschritt fügt man dem klaren Überstand Isopropanol (96%) hinzu. Die im klaren Überstand befindliche Plasmid-DNA wird gefällt und kann abzentrifugiert werden. Verbliebene RNA und andere niedermolekulare Oligonucleotide bleiben neben Salzen und noch nicht im vorherigen Schritt gefällten Proteinen in Lösung und können dekantiert werden. In einem abschließenden Waschschritt mit Ethanol (70%) können noch vorhandene Salze weitestgehend entfernt werden. Die so gewonnene Plasmid-DNA liegt nun für weitere Versuche vor.

B. Vorbereitungen durch den Lehrer

a) Zusammenstellung der Versuchsmaterialien:

Bakterien: E. coli Stamm: K-12 DH5a / pBR322 od. pUC18 od. pUC19 od. pAMP

Geräte:
1 Tischzentrifuge (mind. 10000 rpm)
1 Reagenzglas
2 Reaktionsgefäße (1,5 ml) (steril)
1 Kolbenpipettierhilfe
1 Mikropipettierhilfe od. Alternative
2 Glaspipetten (2 ml) (steril)
7 Pipettenspitzen (steril)
1 Pasteurpipette (steril)
1 Eimer bzw. Styroporbehälter mit feingehacktem Eis od. Eisbad
1 Eimer mit Desinfektionsmittel
1 Becher mit autoklavierbarem Beutel für Abfälle
1 Filzstift (wasserfest)
1 Ständer für Reaktionsgefäße (z.B. aus Styropor selbstgebastelt)

Chemikalien und Lösungen:
Lösung 1 (L1): Tris/ HCl (50 mM), EDTA (10 mM), pH 8,0, RNase (100 mg/ml)

Lösung 2 (L2): NaOH (200 mM), SDS (1%)

Lösung 3 (L3): Kaliumacetat (3,0 M), mit Essigsäure (100%) auf pH 5,5 eingestellt.

LB-Medium:
Isopropanol
Ethanol 70%
TE-Puffer

b) Ansetzen der Lösungen:

- 0,601 g Tris Base wird mit 0,372 g Na-EDTA in 80 ml destilliertem H₂0 gelöst und mit HCl auf pH 8,0 eingestellt und anschließend mit destilliertem H₂0 auf 100 ml aufgefüllt;

- Zugabe der RNase (100 mg/ml).

Lagerung: Nach Zugabe der RNase ist die Lösung im Kühlschrank bei 4 °C aufzubewahren, dort für 6 Monate haltbar.

Gefahrstoffe und Entsorgung:
- EDTA:
R 22: Gesundheitsschädlich beim Verschlucken.
R 36/38: Reizt die Augen, reizt die Haut.
Entsorgung: Sammelgefäß 1 (Halogenfreie organische Lösungsmittel und Lösungen organischer Stoffe).

- HCl (Salzsäure):
R34: Verursacht Verätzungen.
R37: Reizt die Atmungsorgane.
Entsorgung: Neutralisieren, in den Ausguß geben.

- 0,8 g NaOH Pellets werden in 95 ml destilliertem H₂0 gelöst;

- Zugabe von 5 ml einer 20% SDS-Lösung

Lagerung: Bei Raumtemperatur.

Gefahrstoffe und Entsorgung:

- SDS (Dodecylsulfat-Natriumsalz):
R 22: Gesundheitsschädlich beim Verschlucken.
R 36/38: Reizt die Augen, reizt die Haut.
Entsorgung: Sammelgefäß 1 (Halogenfreie organische Lösungsmittel und Lösungen organischer Stoffe).

- NaOH (Natriumhydroxid):
R 35: Verursacht schwere Verätzungen.
Entsorgung: Neutralisieren und in den Ausguß geben.

- 29,45 g Kaliumacetat werden in 50 ml destilliertem H₂0 gelöst und mit Eisessig auf pH 5,5 eingestellt, anschließend wird das Volumen auf 100 ml mit destilliertem H₂0 aufgefüllt.

Lagerung: Bei 4 °C im Kühlschrank.

Gefahrstoffe und Entsorgung:

- Kaliumacetat:
R 35: Verursacht schwere Verätzungen.
Entsorgung: Neutralisieren und in den Ausguß geben.

- Eisessig (Essigsäure 100%):
R 35: Verursacht schwere Verätzungen.
Entsorgung: Neutralisieren und in den Ausguß geben.

LB-Medium:
10 g Trypton (Casein Hydrolysat),
5 g Hefe-Extrakt,
10 g NaCl

werden mit 1 l destilliertem Wasser aufgefüllt, mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt und autoklaviert (20 Min., 121 °C, 1 bar).

Lagerung: Nach dem Autoklavieren bei Raumtemperatur. Haltbar für mehrere Monate.

Gefahrstoffe:
® siehe Einzelrezepte.

Entsorgung:
a) gebrauchte Reaktionsgefäße und Pipettenspitzen im autoklavierbaren Beutel sammeln und autoklavieren.
b) Lösungen: ® siehe Einzelrezepte.

Bezugsquellen für die Materialien ® siehe Materialliste (Kapitel 3).

Sterilität bei Pipettenspitzen und Reaktionsgefäßen ist auch gegeben, wenn sie direkt mit einem sauberen Gummihandschuh der industriellen Transportverpackung entnommen werden (Kapitel 6.6).

Alternative Pipettierhilfe ® Kapitel 6.8.

RNase-Zugabe in Lösung 1 ist für das Erreichen eines guten Präparationsergebnisse nicht entscheidend, allenfalls für ein „saubereres" Elektrophoreseergebnis von Nutzen, da Plasmid-Banden nicht durch langgezogene RNA-Banden verdeckt werden können (Kapitel 6.1.4.5).

C. Versuchsdurchführung (ca. 71 - 76 Minuten)

Von einem ampicillinhaltigen Nährboden mit durch Plasmiden vermittelten ampicillinresistenten E. coli Kolonien wird eine Übernachtkultur angesetzt, indem 5 ml LB-Medium angeimpft werden und über Nacht bei 37 °C geschüttelt bzw. belüftet werden.

Aus der Übernachtkultur werden aus 3 ml Suspension Bakterienzellen geerntet, indem 2x hintereinander jeweils 1,5 ml der Bakteriensuspension mit einer Pipette (2 ml) in das Reaktionsgefäß gegeben und abzentrifugiert werden
(2 Min. bei maximaler Umdrehungszahl), wobei nach jedem Zentrifugationsschritt der Überstand in einen Eimer mit Desinfektionsmittel dekantiert wird.

Die Bakterien werden dann in 0,25 ml L1 sorgfältig resuspendiert, z.B. indem vorsichtig die Flüssigkeit über das Pellet geschichtet und beides mit dem Finger aufgeschnippt wird oder mit einer Pasteurpipette oder einer anderen Pipettierhilfe (z.B. Mikropipettierhilfe) durch Einsaugen und nachfolgendem langsamen Ablassen vermengt werden. Am Ende dürfen keine Zellklumpen mehr in der Suspension zu sehen sein.

Zugabe von 0,25 ml L2. Die Flüssigkeiten im Reaktionsgefäß werden durch einmaliges vorsichtiges Umdrehen des Reaktionsgefäßes miteinander vermischt und dann für maximal 5 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen.

Zugabe von 0,25 ml L3. Die Flüssigkeiten im Reaktionsgefäß werden durch wiederholtes, aber behutsames Umdrehen miteinander vermischt.

Zentrifugation des Reaktionsgefäßes bei maximaler Umdrehungszahl
für 15 Min.

Nach der Zentrifugation wird der Überstand (darin befinden sich die Plasmide) in ein neues Reaktionsgefäß gefüllt. Das Pellet (enthält chromosomale DNA, Zellwandmaterial u.a.) im alten Gefäß wird verworfen (autoklavierpflichtig).

Dem Reaktionsgefäß mit den Plasmiden werden 0,5 ml Isopropanol beigegeben, vorsichtig geschüttelt und erneut bei maximaler Umdrehungszahl für 15 Min. zentrifugiert.

Der Überstand wird vorsichtig in den Eimer mit Desinfektionsmittel dekantiert. Die Plasmide befinden sich in einem kaum sichtbaren Pellet am Boden des Reaktionsgefäßes. Es werden nun 0,15 ml eiskalten Ethanols (70%) in das Reaktionsgefäß gegeben und für 5 Min. bei maximaler Umdrehungszahl zentrifugiert.

Der Überstand wird vorsichtig in den Eimer mit Desinfektionsmittel dekantiert. Um evtl. im Reaktionsgefäß verbliebenes Ethanol vollständig zu entfernen wird das Gefäß für ca. 10 Min. mit offenem Verschluß bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Plasmid-DNA befindet sich in einem kaum sichtbaren Pellet am Boden des Reaktionsgefäßes.

Dem Reaktionsgefäß werden 50 µl TE-Puffer (L1) beigegeben.

Pipettieren: Beim Pipettieren ist darauf hinzuweisen, daß die Flüssigkeit am Boden des Reaktionsgefäßes abgesetzt wird und sich keine Tropfen an der Wand befinden. Dadurch wird ein optimales Mischungsverhältnis erreicht. Notfalls sollten die Reaktionsgefäße anzentrifugiert werden.

Beim Pipettieren von Lösungen und bei der Handhabnung biologischer Materialien sollten die Schüler grundsätzlich Handschuhe tragen.

 

D. Auswertung

Ob und in welcher Menge Plasmide isoliert werden konnten, läßt sich in einer
gelelektrophoretische Auftrennung (Kapitel 5.3) überprüfen. Die Plasmid-DNA kann vor ihrer Auftrennung während der Gelelektrophorese mit Restriktionsenzymen geschnitten werden, wobei neben der exakten Feststellung der Plasmidgröße und einer genaueren Mengenabschätzung der isolierten Plasmid-DNA, auch eine weitere in der Gentechnik verwendete molekularbiologische Methode in ihrer Anwendung gezeigt werden könnte.
Ferner kann die isolierte Plasmid-DNA im Laufe der Versuchsreihe für eine Transformation von E. coli verwendet werden, dafür muß sie allerdings adäquat gelagert werden.

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