5 Das Schülerexperiment zur genetischen Transformation

Das Kapitel ist in die einzelnen Experimente unterteilt. Jedes Experiment ist dann nochmals in einen Lehrer- und Schülerteil gegliedert. Der Lehrerteil enthält eine Sachinformation zum jeweiligen Experiment mit darin integriertem theoretischen Hintergrundwissen, Informationen über die von ihm zu leistenden Vorarbeiten, detaillierte Angaben zum Versuchsablauf und Hinweise zur Auswertung. Der Schülerteil ist auch wegen einer besseren Transparenz ähnlich aufgebaut. Im wesentlichen unterscheidet sich der Lehrer- vom Schülerteil durch detailliertere Informationen im Lehrerteil, die für den Schüler nicht zwingend relevant sind. So z.B. Hinweise zur zeitlichen Konzeption der Versuche und Rezepte für anzusetzende Lösungen und Medien. Der Schülerteil ist so aufgebaut, daß er als Kopiervorlage dienen kann. Damit der Lehrer die Möglichkeit hat, auf seinen Unterricht bezogene Modifikationen im Schülerteil vornehmen zu können, sollen die Schülerteile der Experimente auf Diskette abgespeichert werden. Interessierten Lehrern können diese dann zur Verfügung gestellt bekommen.

Um mit DNA gezielt arbeiten zu können, z.B. für den Fall, daß Gene identifiziert und ihre Basenabfolge bestimmt oder sie gezielt verändert werden soll, ist es notwendig sie außerhalb der Zelle (in vitro) und in gereinigter Form, d.h. frei von anderen Zellbestandteilen wie Proteinen, Enzymen und Lipiden, vorliegen zu haben. Die Präparation von DNA kann in zwei grundsätzliche Schritte unterteilt werden: 1. Die Zellwände der Zellen müssen zerstört werden, damit ihr Inhalt frei wird.
2. Die im Zellextrakt enthaltene DNA wird so behandelt, daß alle Bestandteile außer der DNA entfernt werden (BROWN 1993).

Am Beispiel der Präparation von Plasmid-DNA aus dem Bakterium E. coli soll das Prinzip der Isolierung und Reinigung von DNA deutlich werden. Die Plasmid-DNA dient zu dem als Ausgangspunkt für weitere Versuche innerhalb der Versuchsreihe. Eine Überprüfung der Ergebnisse erfolgt in Form der Gelelektrophorese, die an anderer Stelle erläutert wird.

Für die Präparation von Plasmid-DNA stehen unterschiedliche Methoden zur Verfügung. Von diesen werden zwei im einzelnen nachfolgend erläutert.

A. Sachinformation

Diese Methode bezieht ihren Namen aus dem Teilschritt der Präparation, bei dem der Versuchsansatz kurzzeitig aufgekocht wird. Bevor der Versuchsansatz allerdings aufgekocht wird, werden in einem ersten Schritt die Bakterienzellen aufgebrochen bzw. lysiert. Dafür werden die Bakterienzellen in STET-Puffer resuspendiert. Tris-HCl im STET-Puffer sorgt dabei für die Puffereigenschaften. Das EDTA im Puffer fungiert als Komplexbildner und bindet Kalziumionen, die die äußerste Schicht der Zellwand stabilisieren. Diese äußerste Schicht besteht aus Proteinen, Phospholipiden und Lipopolysacchariden und ist dem ein- bis zweischichtigen Mureinsacculus aufgelagert. Man spricht dabei auch von einer äußeren Membran. Die Bindung der Kalziumionen erleichtert die Zerstörung des Mureinsacculuses durch die im STET-Puffer enthaltene nichtionische Detergens
Triton-X-100^â . Diese zerstört die Peptidbindungen zwischen den einzelnen heteropolymorphen Ketten, bestehend aus der alternierenden Abfolge von N-Acetylglucosamin und N-Acetylmuraminsäure, die den netzförmigen Sacculus ausbilden. Verstärkt wird die Zerstörung des Mureinsacculuses durch die Zugabe von Lysozym, einem Enzym, was die Verknüpfung zwischen den Kettengliedern N-Acetylglucosamin und N-Acetylmuraminsäure spaltet. Lysozym, 1922 von A. Flemming entdeckt, kommt in der Tränenflüssigkeit, den Nasenschleimhäuten und im Eiklar vor. Ferner wurde es auch aus einigen Bakterien isoliert.

Durch die Einwirkungen von EDTA, Triton-X-100^â und Lysozym wird die Zellwand in relativ kurzer Zeit so weit zerstört, das ein Sphäroplast vorliegt, eine Batkerienzelle mit partiell aufgelöster Zellwand, aber noch intakter Cytoplasmamembran. Die im STET-Puffer enthaltene Sucrose verhindert durch ihre Konzentration im Puffer, die in etwa der des Cytosols der Bakterienzelle entspricht, ein Platzen des Sphäroplasten. Man will dadurch vermeiden, daß die chromosomale Bakterien-DNA durch beim Platzen auftretende Scherkräfte in kleinere Fragmente zerstückelt wird, welche schwieriger von der zu gewinnenden Plasmid-DNA zu trennen sind. Als Detergens hat Triton-X-100^â die Fähigkeit die Cytoplasmamembran zu lysieren, wodurch die Cytosolbestandteile und damit auch die Plasmid-DNA freigesetzt werden. Um nun die Plasmid-DNA von den anderen Cytosolbestandteilen zu isolieren, wird der Versuchsansatz kurz aufgekocht. Dabei werden Proteine sowie die chromosomale DNA denaturiert. Die beiden DNA-Stränge der chromosomalen DNA-Bruchstücke können nach dem Kochschritt wieder renaturieren, allerdings werden Basenpaarungen mit unterschiedlichen DNA-Strängen eingegangen, wodurch ein verworrenes Geflecht entsteht, was im folgendem neben den Proteinen, Zellmembran- und Zellwandbestandteilen abzentrifugiert werden kann und als Pellet erscheint. Plasmid-DNA wird auch denaturiert, ist aber aufgrund seiner geringeren Komplexität und der erhaltenen Ringstruktur zur vollständigen Renaturierung fähig. Sie befindet sich nach der Zentrifugation im klaren Überstand.
In Anwesenheit von Isopropanol wird Plasmid-DNA gefällt und kann abzentrifugiert werden. RNA und andere niedermolekulare Oligonucleotide bleiben neben Salzen und noch nicht im vorherigen Schritt gefällten Proteinen in Lösung und können dekantiert werden.

a) Zusammenstellung der Versuchsmaterialien:

Bakterien: E. coli Stamm: K-12 DH5a / pBR322 od. pUC18 od. pUC19 od. pAMP

b) Ansetzen der Lösungen:

Lagerung: Im Kühlschrank haltbar für mehrere Monate.

Gefahrstoffe und Entsorgung:
- EDTA (Ethylendinitrilotetraessigsäure):
R 22: Gesundheitsschädlich beim Verschlucken.
R 36/38: Reizt die Augen, reizt die Haut.
Entsorgung: Sammelgefäß 1 (Halogenfreie organische Lösungsmittel und Lösungen organischer Stoffe).

- Triton-X-100^â :
R 22: Gesundheitsschädlich beim Verschlucken.
R 36/38: Reizt die Augen, reizt die Haut.
Entsorgung: Sammelgefäß 1 (Halogenfreie organische Lösungsmittel und Lösungen organischer Stoffe).

- HCl (Salzsäure):
R34: Verursacht Verätzungen.
R37: Reizt die Atmungsorgane.
Entsorgung: Neutralisieren, in den Ausguß geben.

Lagerung: Im Kühlschrank haltbar für mehrere Monate.

Gefahrstoffe und Entsorgung:
- EDTA (Ethylendinitrilotetraessigsäure):
R 22: Gesundheitsschädlich beim Verschlucken.
R 36/38: Reizt die Augen, reizt die Haut.
Entsorgung: Sammelgefäß 1 (Halogenfreie organische Lösungsmittel und Lösungen organischer Stoffe).

- HCl (Salzsäure):
R34: Verursacht Verätzungen.
R37: Reizt die Atmungsorgane.
Entsorgung: Neutralisieren, in den Ausguß geben.

Gefahrstoffe:
® siehe Einzelrezepte.

Entsorgung:
a) gebrauchte Reaktionsgefäße und Pipettenspitzen im autoklavierbaren Beutel sammeln und autoklavieren.
b) Lösungen: ® siehe Einzelrezepte.

Bezugsquellen für die Materialien ® siehe Materialliste (Kapitel 3).

Sterilität bei Pipettenspitzen und Reaktionsgefäßen ist auch gegeben, wenn sie direkt mit einem sauberen Gummihandschuh der industriellen Transportverpackung entnommen werden (Kapitel 6.6).

Alternative Pipettierhilfe ® Kapitel 6.8.

 

Von einem ampicillinhaltigen Nährboden mit durch Plasmiden vermittelten ampicillinresistenten E. coli Kolonien werden 10 Kolonien mit Hilfe einer Impföse oder eines Glasstabes abgenommen und in 200 µl eiskaltem STET-Puffer des Reaktionsgefäßes überführt.

Die Kolonien werden mit Hilfe der Mikropipettierhilfe und Pipettenspitze (od. Pasteurpipette) im STET Puffer des Reaktionsgefäßes durch wiederholtes Einsaugen und Ablassen soweit resuspendiert, daß keine Zellklumpen mehr zu sehen sind.

In den Verschluß des Reaktionsgefäßes wird mit einer Nadel ein kleines Loch gestochen (dient dem Druckausgleich innerhalb des Reaktionsgefäßes während des Erhitzungsschrittes unter 5.).

Zugabe von 5 µl der Lysozymlösung zu den Versuchsansätzen. Das Reaktionsgefäß wird dann verschlossen.

Im Styroporeinsatz wird das Reaktionsgefäß für 90 s in das kochende Wasser gestellt.

Zentrifugation für 15 Min. bei mind. 10000 rpm.

Das Pellet (enthält chromosomale DNA, Zellwandmaterial u.a.) wird mit einem sterilen Zahnstocher aus dem Reaktionsgefäß geborgen und zusammen mit dem Zahnstocher dem Becher mit autoklavierpflichtigem Abfall zugeführt. Die Plasmide befinden sich in dem klaren Überstand.

Dem Reaktionsgefäß werden 200 µl Isopropanol beigegeben und bei 10000 rpm für 15 Min zentrifugiert.

Der Überstand wird dekantiert. Um evtl. im Reaktionsgefäß verbliebenes Isopropanol vollständig zu entfernen, wird das Gefäß für ca. 10 Min. mit offenem Verschluß bei Raumtemperatur stehen gelassen, dabei verdampft der Rest des Isopropanols. Die Plasmid-DNA befindet sich in einem kaum sichtbaren Pellet am Boden des Reaktionsgefäßes.

Dem Reaktionsgefäß werden 50 µl TE-Puffer (steril) beigegeben.

Pipettieren: Beim Pipettieren ist darauf hinzuweisen, daß die Flüssigkeit am Boden des Reaktionsgefäßes abgesetzt wird und sich keine Tropfen an der Wand befinden. Dadurch wird ein optimales Mischungsverhältnis erreicht. Notfalls sollten die Reaktionsgefäße anzentrifugiert werden.

Beim Pipettieren von Lösungen und bei der Handhabung biologischer Materielalien sind grundsätzlich Handschuhe zutragen.

 

Ob und in welcher Menge Plasmide isoliert werden konnten, läßt sich in einer
gelelektrophoretische Auftrennung (Kapitel 5.3) überprüfen. Die Plasmid-DNA kann vor ihrer Auftrennung während der Gelelektrophorese mit Restriktionsenzymen geschnitten werden, wobei neben der exakten Feststellung der Plasmidgröße und einer genaueren Mengenabschätzung der isolierten Plasmid-DNA, auch eine weitere in der Gentechnik verwendete molekularbiologische Methode in ihrer Anwendung gezeigt werden könnte.
Ferner kann die isolierte Plasmid-DNA im Laufe der Versuchsreihe für eine Transformation von E. coli verwendet werden, dafür muß sie allerdings adäquat gelagert werden.

a) Zusammenstellung der Versuchsmaterialien:

Bakterien: E. coli Stamm: K-12 DH5a / pBR322 od. pUC18 od. pUC19 od. pAMP

Geräte:
1 Tischzentrifuge (mind. 10000 rpm)
1 Heizplatte
1 Vortexgerät
1 Kochtopf od. hitzebeständiges Becherglas
1 Schwimmeinsatz, z.B. aus Styropor (für Reaktionsgefäße beim Kochschritt)
1 Impföse
1 Bunsenbrenner
1 Reagenzglas (steril)
1 Wasserbad 37 °C mit Schütteleinrichtung
1 Reaktionsgefäß (1,5 ml) (steril)
1 Kolbenpipettierhilfe
1 Mikropipettierhilfe (od. Alternative)
2 Glaspipetten (2 ml) (steril)
3 Pipettenspitzen (steril)
1 Eimer bzw. Styroporbehälter mit feingehacktem Eis od. Eisbad
1 Eimer mit Desinfektionsmittel
1 Becher mit autoklavierbarem Beutel für Abfälle
1 Filzstift (wasserfest)
1 Ständer für Reaktionsgefäße (kann aus Styropor selbstgebaut werden)
1 Zahnstocher (steril)
1 Sicherheitsnadel

Chemikalien, Nährmedien u. Lösungen:

b) Ansetzen der Lösungen:

werden mit 1 l destilliertem Wasser aufgefüllt, mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt und autoklaviert (20 Min., 121 °C, 1 bar).

Lagerung: Nach dem Autoklavieren bei Raumtemperatur. Haltbar für mehrere Monate.

Für 50 ml: 4 g Sucrose, 2,5 ml Triton-X-100^â, 0,84 g Na-EDTA, 0,3 g Tris-HCl werden in 40 ml destilliertem Wasser gelöst und mit HCl auf pH 8,0 eingestellt. Anschließend wird das Volumen mit destilliertem Wasser auf 50 ml aufgefüllt.

Lagerung: Im Kühlschrank haltbar für mehrere Monate.

Gefahrstoffe und Entsorgung:
- EDTA:
R 22: Gesundheitsschädlich beim Verschlucken.
R 36/38: Reizt die Augen, reizt die Haut.
Entsorgung: Sammelgefäß 1 (Halogenfreie organische Lösungsmittel und Lösungen organischer Stoffe).

- Triton-X-100^â :
R 22: Gesundheitsschädlich beim Verschlucken.
R 36/38: Reizt die Augen, reizt die Haut.
Entsorgung: Sammelgefäß 1 (Halogenfreie organische Lösungsmittel und Lösungen organischer Stoffe).

- HCl (Salzsäure):
R34: Verursacht Verätzungen.
R37: Reizt die Atmungsorgane.
Entsorgung: Neutralisieren, in den Ausguß geben.

Für 100 ml: 0,12 g Tris-HCl und 0,034 g Na-EDTA werden in 80 ml destilliertem Wasser gelöst und mit HCl auf pH 8,0 eingestellt. Anschließend wird das Volumen mit destilliertem Wasser auf 50 ml aufgefüllt.

Lagerung: Im Kühlschrank haltbar für mehrere Monate.

Gefahrstoffe und Entsorgung:
- EDTA:
R 22: Gesundheitsschädlich beim Verschlucken.
R 36/38: Reizt die Augen, reizt die Haut.
Entsorgung: Sammelgefäß 1 (Halogenfreie organische Lösungsmittel und Lösungen organischer Stoffe).

- HCl (Salzsäure):
R34: Verursacht Verätzungen.
R37: Reizt die Atmungsorgane.
Entsorgung: Neutralisieren, in den Ausguß geben.

Lagerung: Nur kurzfristig haltbar. Am besten kurz vor Versuchsbeginn ansetzen und bis zum Gebrauch kaltstellen.

Gefahrstoffe:
® siehe Einzelrezepte.

Entsorgung:
a) gebrauchte Reaktionsgefäße und Pipettenspitzen im autoklavierbaren Beutel sammeln und autoklavieren.
b) Lösungen: ® siehe Einzelrezepte.

Bezugsquellen für die Materialien ® siehe Materialliste (Kapitel 3).

Sterilität bei Pipettenspitzen und Reaktionsgefäßen ist auch gegeben, wenn sie direkt mit einem sauberen Gummihandschuh der industriellen Transportverpackung entnommen werden (Kapitel 6.6).

Alternative Pipettierhilfe ® Kapitel 6.8.

 

Von einem ampicillinhaltigen Nährboden mit durch Plasmiden vermittelten ampicillinresistenten E. coli Kolonien wird eine Übernachtkultur angesetzt, indem 5 ml LB-Medium angeimpft werden und über Nacht bei 37 °C geschüttelt bzw. belüftet werden.

Aus der Übernachtkultur werden aus 3 ml Suspension Bakterienzellen geerntet, indem 2x hintereinander jeweils 1,5 ml der Bakteriensuspension mit einer Pipette (2 ml) in das Reaktionsgefäß gegeben und abzentrifugiert werden
(2 Min. bei minimal 10000 rpm), wobei nach jedem Zentrifugationsschritt der Überstand in einen Eimer mit Desinfektionsmittel dekantiert wird.

Der Überstand wird in den Eimer mit Desinfektionsmittel gegeben.

Das Pellet wird heftig gevortext.
ODER: Nach Zugabe des STET-Puffer unter 5. in diesem resuspendiert.

Dem Reaktionsgefäß werden 350 µl STET Puffer zugegeben.

In den Verschluß des Reaktionsgefäßes wird mit einer Nadel ein kleines Loch gestochen. Das dient dem Druckausgleich innerhalb des Reaktionsgefäßes während des Erhitzungsschrittes unter 8.

Dem Reaktionsgefäß werden 25 µl Lysozymlösung zugegeben.

Im Styroporeinsatz wird das Reaktionsgefäß für 90 s in das kochende Wasser gestellt.

Zentrifugation für 15 Min. bei mindestens 10000 rpm.

Das Pellet, welches chromosomale DNA, Zellwandmaterial u.a. enthält, wird mit einem sterilen Zahnstocher aus dem Reaktionsgefäß herausgeholt und zusammen mit dem Zahnstocher in den Becher mit autoklavierpflichtigem Abfall überführt. Die Plasmide befinden sich in dem klaren Überstand.

Dem Reaktionsgefäß werden 350 µl Isopropanol beigegeben und bei mindestens 10000 rpm für 15 Min zentrifugiert.

Der Überstand wird vorsichtig in den Eimer mit Desinfektionsmittel dekantiert. Um im Reaktionsgefäß verbliebenes Isopropanol vollständig zu entfernen, wird das Gefäß für ca. 10 Min. mit offenem Verschluß bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Plasmid-DNA befindet sich in einem kaum sichtbaren Pellet am Boden des Reaktionsgefäßes.

Dem Reaktionsgefäß werden 50 µl TE-Puffer (steril) beigegeben.

Ob und in welcher Menge Plasmide isoliert werden konnten, läßt sich in einer
gelelektrophoretische Auftrennung (Kapitel 5.3) überprüfen. Die Plasmid-DNA kann vor ihrer Auftrennung während der Gelelektrophorese mit Restriktionsenzymen geschnitten werden, wobei neben der exakten Feststellung der Plasmidgröße und einer genaueren Mengenabschätzung der isolierten Plasmid-DNA, auch eine weitere in der Gentechnik verwendete molekularbiologische Methode in ihrer Anwendung gezeigt werden könnte.
Ferner kann die isolierte Plasmid-DNA im Laufe der Versuchsreihe für eine Transformation von E. coli verwendet werden, dafür muß sie allerdings adäquat gelagert werden.

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