6.4 Untersuchungen zur Transformation von Bakterienzellen

6.4.1 Einleitung

Für die Transformation von Bakterienzellen müssen diese zuerst in einen Zustand versetzt werden, der es ihnen ermöglicht, von außen zugeführte Plasmide aufnehmen zu können. In diesem Fall spricht man von kompetenten Zellen. Empirisch konnte festgestellt werden, daß die Zellen durch die Zugabe von CaCl₂ durchlässig für DNA werden. Detailierte Kenntnisse über die dabei zugrunde liegenden zellulären bzw. biochemischen Ursachen sind bis heute noch nicht geklärt.
Es lassen sich zwei Wege der Gewinnung kompetenter Zellen nach der CaCl₂-Methode voneinander unterscheiden, die sowohl in der Versuchsdurchführung, der dafür benötigten Zeit als auch in ihrem Versuchsergebnis differieren. Der eine Weg, der im Lehrermanual als Methode A bezeichnet wird, nimmt den Ausgangspunkt von auf einem Agarnährboden gewachsenen Bakterienkolonien. Der als Methode B bezeichnete zweite Weg hat seinen Ausgangspunkt in einer mit Bakterien angeimpften für 12-24 h inkubierten Flüssigkultur.

Die beiden Wege sollten unter dem Gesichtspunkt der Durchführbarkeit im Schulunterricht überprüft und optimiert werden. Die Optimierung sollte vor allem auf eine Reduzierung des materiellen und zeitlichen Aufwandes abzielen. Untersucht wurden in dem Zusammenhang die Fragen der Notwendigkeit einer Ausprägungsphase im Anschluß an den Transformationschritt, in der die transformierten Zellen das auf dem Plasmid codierte Enzym ß-Lactamase für Ampicillinresistenz synthetisieren können, bevor sie auf Selektivmedien ausplattiert werden sowie mögliche Konsequenzen einer Inkubation von Agarnährbodenplatten mit transformierten Bakterienzellen bei Raumtemperatur und nicht in einem Brutschrank bei 37 °C. Es stellte sich die Frage, nach welcher Zeit von einer bei Raumtemperatur gehaltenen Agarplatte E. coli-Zellen für die Gewinnung kompetenter Zellen gewonnen werden konnten.

Nach Angaben von DAGERT und EHRLICH (1979) kann eine 24stündige Lagerung der nach Methode B gewonnenen kompetenten Zellen auf Eis die Kompetenz um das 20-30fache und die Transformationseffizienz um das 5-10fache heraufsetzen. Diese Aussage sollte im Zuge einer Transformation nach Methode B überprüft werden.

6.4.2 Material und Methoden

Die Versuche wurden basierend auf den im Lehrermanual des Kapitels 5.4.1 und 5.4.3 verwendeten Materialien und Methoden durchgeführt.

Für die Transformation sind ausschließlich Bakterien vom Stamm E. coli K 12 DH5a verwendet worden. Die transformierten Bakterienzellen wurden auf ampicillinhaltigen LB-Nährbodenplatten in der im Versuchsprotokoll angebenen Konzentration von 50 µg Ampicillin pro ml Medium selektioniert. Ausgestrichen wurden auf jeder Agarplatte jeweils 0,1 ml des Transformationsansatzes. Die anschließende Inkubation der Agarplatten fand in einem 37 °C warmen Brutraum statt. Die Auszählung der Bakterienkolonien erfolgte optisch. Bei den Ergebnissen, bei denen dem Zahlwert das Zeichen „~" vorangeht, wurde eine Abschätzung der Kolonien anhand der Kolonienzahl der 1/10-Verdünnung vorgenommen. Kontrollansätze liefen bei jeder Transformation mit. Bei den Kontrollansätzen handelt es sich um Bakterienzellen, die alle Versuchsschritte durchlaufen, denen aber keine Plasmid-DNA zugegeben wird. Die negative Kontrolle bestand im Ausplattieren von kompetenten Zellen ohne Plasmidzusatz auf einer ampicillinhaltigen LB-Nährbodenplatte und diente der Überprüfung, ob die Bakterienzellen nicht bereits vor der Transformation ampicillinresistent waren. Hier dürfen sich auf der Agarplatte nach Inkubation keine Bakterienkolonien befinden. Die positive Kontrolle belegt beim Ausplattieren von kompetenten Zellen ohne Plasmidzusatz auf einem LB-Nährboden, dem kein Ampicillin zugesetzt wurde, die Vitalität der Bakterien. Auf diesen Agarplatten sollten sich nach Inkubation Bakterienkolonien befinden, die normalerweise die gesamte Agarplatte bedecken und einen sogenannten Bakterienrasen bilden.

6.4.3 Ergebnisse

Eine Übersicht der Ergebnisse zu den durchgeführten Transformationen nach Methode A und B sind, nach Transformationsmethode und dabei verwendetem Plasmid getrennt, in den Tabellen 19 - 22 dargestellt. Allgemein beinhalten die einzelnen Tabellen Angaben über das für die Transformation verwendete Plasmid, nach welcher Methode das Plasmid gewonnen wurde und die für die Transformation eingesetzte Plasmidmenge in Nanogramm (ng) sowie die daraus resultierende Zugabe zum Transformationsansatz in Mikrolitern (µl). Darüber hinaus enthalten sie Informationen, ob und in welcher Verdünnung die transformierten Zellen auf den Agarplatten ausgestrichen wurden, die Anzahl der auf den Agarplatten nach Inkubation vorgefundenen Kolonien und die Werte zur Transformationseffizienz. Diese ergeben sich aus der Berechnung des Verhältnisses zwischen Kolonienzahl und der für die Transformation eingesetzten Menge an Plasmid-DNA, ausgedrückt in Kolonien pro Mikrogramm Plasmid. Spezielle Informationen, die auf eine Tabelle bezogen sind, werden in der Beschriftung der entsprechenden Tabelle aufgeführt. In der Spalte, in der keine Angaben zur Plasmidpräparation gemacht worden sind, wurden für das Transformationsexperiment Plasmide von Mitarbeitern des Instituts für Genetik der Universität zu Köln zur Verfügung gestellt. Mitgelaufene Kontrollen entsprachen bei den durchgeführten Transformationen den oben formulierten Erwartungen und sind nicht explizit in die Tabellen aufgenommen worden.

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