Ferienakademie

Prof. Dr. Peter Nürnberg

Viele der Mechanismen, die den Alterungsprozessen zugrunde liegen, sind genetisch kontrolliert. Ziel der Untersuchung von genetisch bedingten, altersassoziierten Erkrankungen ist die Entwicklung neuartiger Therapien für diese Erkrankungen und zugleich die allgemeine molekulare Charakterisierung von Vorgängen des Alterns. Prof. Nürnberg ist Gründer und Leiter des Cologne Center for Genomics (CCG). Das CCG nutzt verschiedene modernste Techniken wie z. B. die Chip-basierten SNP-Typisierung und sowie Methoden zur DNA-Sequenzierung, um DNA, RNA und Proteine zu analysieren. Ziel dieser Untersuchungen ist zum einen die Genkartierung bei monogenen Krankheiten (z. B. Ichthyose), d. h. die Suche nach dem jeweiligen krankheitsrelevanten Gen bzw. die Suche nach genetische Variationen im Rahmen von Assoziationsstudien bei komplexen Erkrankungen (z. B. Epilepsie), die durch mehrere genetische Faktoren bestimmt werden. Im Rahmen eines CECAD Forschungsprojektes untersucht das CCG, welche genetischen Faktoren die Dupuytren´sche Krankheit auslösen. Die Erkrankung tritt meist im mittleren Lebensalter auf und ist die häufigste genetisch bedingte Bindegewebserkrankung. Schätzungen zufolge sind ca. 20 % der 30- bis 50-Jährigen und 40 % der 80-Jährigen in der europäischen Bevölkerung davon betroffen. Charakteristisch für die Dupuytren´sche Krankheit ist das Auftreten von gutartigen Knoten und Strängen an der Handinnenfläche, die im Verlauf der Zeit die Streckung der betroffenen Finger behindern und schließlich zu deren dauerhaften Verkrümmung führen (siehe Abb. 1). Um genetische Faktoren zu entdecken, die an dieser Störung beteiligt sind, sucht das CCG nach Varianten im humanen Erbgut (Genom), die mit der Ausprägung der Krankheit assoziiert sind. Dazu werden bei einer großen Zahl von Probanden Proben der DNA isoliert und mit vielen genetischen Markern, also kurzen DNA-Abschnitten, typisiert. Diese Techniken werden in der Ferienakademie zur Alternsforschung exemplarisch vorgestellt und die familiäre Segregation von Merkmalen, auf der die molekulargenetische Analyse basiert, untersucht.

Abb. 1: Dupuytren´sche Erkrankung im fortgeschrittenen Stadium mit Kontraktur des Kleinfingers der linken bzw. der rechten Hand.
Bildquelle: Dissertation von K. Winkler „Die Dupuytren-Kontraktur“.

Beschreibung der Experimente

Die DNA - die Erbsubstanz eines Individuums - ist Grundlage der Experimente des Praktikums. Voraussetzung für eine Genkartierung ist u. a., dass die Verwandtschaftsverhältnisse in den zu untersuchenden Familien eindeutig geklärt sind. Diese wie auch die Geschlechter der untersuchten Proben müssen im Verlauf der Genkartierung nochmals überprüft werden. Wie eine solche Überprüfung vorgenommen wird, werden die Teilnehmer im Verlauf des Praktikums erfahren.

Am ersten Tag des Praktikums wird jeder Schüler DNA aus seinem Speichel isolieren. Der zweite Tag umfasst die Messung bzw. Abschätzung der DNA-Konzentration. Alle Proben werden anonymisiert und zusammen mit Proben einer Familie (Mutter, Vater, Kind) weiter untersucht. Es folgt eine Analyse von kurzen, nicht kodierenden DNA-Sequenzen (Mikrosatelliten), die als genetische Marker bei der Suche nach Krankheitsgenen (Genkartierung) verwendet werden. Die zu untersuchenden Marker stammen von unterschiedlichen Autosomen sowie vom X-Chromosom.

Mikrosatelliten sind genetische Marker, denn charakteristisch für Mikrosatelliten ist die unterschiedliche Anzahl der Wiederholungen bei einzelnen Individuen und somit das Vorhandensein verschiedener Varianten des Markers (Allele) in einer Population. Basierend darauf kann bei einer Genkartierung genau nachvollzogen werden, welches Allel eines Mikrosatelliten vom Vater und welches von der Mutter weitergegeben wurde (siehe Abb. 2). Somit ist es auch möglich, aus einer Reihe unbekannter DNA-Proben jene herauszufinden, die miteinander verwandt sind. Dies soll das Ziel der Mikrosatelliten-Analyse im Praktikumsversuch sein.

Abb. 2: Nukleotidsequenzen eines Mikrosatellitenmarkers auf beiden Chromosomen eines Individuums.
Auf dem einen Chromosom befindet sich Allel 1 z. B. von der Mutter, das 22 CA-Wiederholungen enthält, und auf dem anderen Chromosom Allel 2 vom Vater, das 19 CA-Wiederholungen aufweist.

Im Praktikumsversuch werden 8-10 Mikrosatellitenmarker zunächst mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt, um anschließend mit Hilfe eines Sequenzierautomaten der Größe nach aufgetrennt zu werden.

Abb. 3: Stammbaum einer Familie mit den dazugehörigen Elektropherogrammen eines Mikrosatellitenmarkers. Der Vater (1-1) ist homozygot für das 210-bp-Fragment und die Mutter (1-2) homozygot für das 206-bp-Fragment. Ihr Sohn ist heterozygot, d. h. er trägt auf dem einen Chromosom das 206-bp- und auf dem anderen das 210-bp-Fragment.

Am dritten Praktikumstag erfolgt die Auswertung der Ergebnisse. Es soll anhand der erhaltenen Genotypen herausgefunden werden, welche Proben von den drei Familienmitgliedern stammen (s. Abb. 3). Außerdem kann mit Hilfe der X-chromosomalen Marker bestimmt werden, welchen Geschlechts die Probeninhaber sind.

Ablauf des Praktikums

1. Tag

Einführung in die Grundlagen der Experimente
Sicherheitsbelehrung
DNA-Isolation aus Speichel

2. Tag

Messung der DNA-Konzentration
Anonymisierung der Proben, Zufügen von Proben einer Familie
PCRs zur Amplifizierung genetischer Marker
Analyse der PCR-Produkte

3. Tag

Auswertung der Ergebnisse
Quiz: Welche Probe gehört zu dem Kind der beiden Eltern? Welchen Geschlechts sind die jeweiligen Probeninhaber?

Datum

Dienstag, den 30. September bis Donnerstag, den 2. Oktober

Ort

Institut für Genetik
Praktikumsraum A, EG
Zülpicher Str. 47
50674 Köln

Anzahl der Teilnehmer: 8 Personen