3.5 Liste alternativer Materialien

Bezeichnung	Bezugsquelle	Best.Nr.	Inhalt	Preis (DM)	Preis/ Stück (DM)
Belüftung:
Aquarienpumpe	Baumarkt o.ä.		1	50,00	50,00
Gummischlauch	Baumarkt o.ä.		1	1,00	1,00
Pasteurpipette	Faust	9.411 015	1000	46,00	0,05

Elektrophorese:
Plastikbox	Baumarkt o.ä.		1	2,00	2,00
Plastik für Kamm	Baumarkt o.ä.		1	1,00	1,00
Krokodilklemmen	Baumarkt o.ä.		2	4,00	2,00
9V Blockbatterien	Baumarkt o.ä.		2	8,00	4,00
Spielzeugeisenbahn-transformator	Warenhaus		1	50,00	50,00
Bleistiftminen (Graphit)	Schreibwaren		10	3,00	0,30
V2A-Stahl	Eisenwarenhandel		1	10,00	10,00
Alu-Folie	Plus, KD etc.		1 Rolle	2,50	2,50
Lambda DNA Kit	NCBE/ IPN		1	£ 110,00	£ 110,00
Gelbox und Kamm	NCBE/ IPN		5	£ 15,00	£ 3,00
DNA Kit Elektrodenmat.	NCBE/ IPN		1 Packung	£ 4,00	£ 4,00

Mikropipette:
Einwegspritze (2 ml)	Apotheke		1	0,25	0,25
Einwegspritze (2 ml)	Apotheke		100	10,87	0,11
Gummischlauch	Baumarkt o.ä.		1	1,00	1,00
Multipette (Combitips 1,25 ml)	Faust	9.283 406	100	105,00	1,05

Reaktionsgefäßständer:
Styropor	Baumarkt o.ä.		1 Platte	2,00	2,00

Tabelle 5: Liste alternativer Materialien (Preise z.T. ohne MwSt).

3.6 Ausgewählte Literatur zur Unterrichtsvorbereitung und für den Einsatz im Unterricht

3.6.1 Gentechnik allgemein

NEVERS, P.: Methoden der Gentechnik. Molekularbiologie, Aufbaublock VI: Gentechnik. IPN, DIFF, Kiel, Tübingen 1991.

NEVERS, P., BACKHAUS, H.: Anwendungsgebiete der Gentechnik. Molekularbiologie, Aufbaublock VI: Gentechnik. IPN, DIFF, Kiel, Tübingen 1991.

NEVERS, P., FÜHR, M., BAYERTZ, K., ZWIERLEIN, E.: Unterrichtsmaterialien zur Gentechnik. Molekularbiologie, Aufbaublock VI: Gentechnik. IPN, DIFF, Kiel, Tübingen 1992.
® 1. - 3.: Umfassender Einstieg in die Grundlagen der Gentechnik und der Anwendunggebiete, zu beziehen über das DIFF für 11 DM pro Exemplar (Adresse siehe Anhang 11.3).

JUNGBAUER, W.: Themenheft Gentechnik. Praxis der Naturwissenschaften - Biologie, Heft 7, 44. Jhg., Aulis Verlag, Köln 1995.
® Anwendungsgebiete der Gentechnik.

FONDS DER CHEMISCHEN INDUSTRIE (Hrsg.): Biotechnologie/ Gentechnik - Textheft zur Folienserie. Frankfurt a.M. 1989.
® Folienserie wird z.Z. neu aufgelegt, erhältlich beim Fonds der Chemischen Industrie, 1 Exemplar ist für Schhulen kostenfrei (Adresse siehe Anhang 11.3).

DIXON, B.: Genetics and the Understanding of Life. Booklet produced for the XVIIth International Congress of Genetics, Birmingham 1993. NCBE 1993.
® Reich bebilderter Einstieg in die Grundlagen der Gentechnik und Anwendungsgebiete, allerdings in englischer Sprache, zu beziehen für £ 3,50 pro Heft über den NCBE (Adresse siehe Anhang 11.3).

BAYRHUBER, H., LUCIUS, E.R. (Hrsg.): Handbuch der praktischen Mikrobiologie und Biotechnik. Bd. 1: Mikrobiologische Grundlagen. Biotechnik der Nahrungs- und Genußmittelproduktion. Schroedel-Metzler, Hannover 1992.
® Anleitungen für den preiswerten Bau von Laborgeräten (z.B. Brutschrank, Wasserbad, Schüttler)

3.6.2 Empfehlungen und Erlasse zur rechtlichen Situation

BAGUV (Bundesverband der Unfallversicherungsträger der öffentlichen Hand e.V.) (Hrsg.): Richtlinien zur Sicherheit im naturwissenschaftlichen Unterricht. Empfehlung der Kultusministerkonferenz vom 9.9.1994. O.O. 1995.
® zu beziehen unter Bestell-Nr. GUV 57.1.29 vom zuständigen Unfallversicherungsträger, für Schulen kostenlos.

KULTUSMINISTERIUM DES LANDES NORDRHEIN-WESTFALEN (Hrsg.): Sicherheit im naturwissenschaftlichem Unterricht an allgemeinbildenden Schulen. Runderlaß des Kultusministeriums vom 20.1.1995. Verlagsgesellschaft Rittersbach, Frechen 1995.

3.7 Eigenschaften von Bakterien und Plasmid-Vektoren

3.7.1 Bakterien

Bei dem im Schülerexperiment zur genetischen Transformation verwendetem Bakterium handelt es sich um Escherichia coli K12 DH5a . Bezogen werden kann der Bakterienstamm über die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM) in Braunschweig. Normalerweise lebt der Wildstamm von Escherichia coli symbiotisch im Darm von den meisten Wirbeltieren inklusive des Menschen. E. coli beteiligt sich dort am Abbau von Nahrung, wofür es im Gegenzug vom Wirt mit Nährstoffen versorgt wird. Außerhalb des Darmmilieus kann E. coli allerdings Infektionen hervorrufen. Aufgrund dessen wird der Wildstamm als fakultativ pathogen bezeichnet.
Die dem Artnamen angefügte Endung K12 bei dem im Schülerexperiment verwendeten Bakterium bezeichnet einen speziellen Bakterienstamm von E. coli. Der Stamm K12 wurde 1922 isoliert und weist im Vergleich zu dem bei Mensch und den meisten Wirbeltieren im Darm gewöhnlich vorkommenden E. coli Bakterien genetische Defizite auf, die es ihm u.a. nicht ermöglichen, an den Darmepithelzellen anzuheften, um sich dort dann anzusiedeln. Aufgrund der genetischen Defizite hat der Bakterienstamm E. coli K12 seine Pathogenität verloren und wird als apathogener sicherer Mikroorganismus anerkannt und deshalb als Sicherheitsstamm bezeichnet. In der Forschung werden E. coli K12 Stämme weltweit als Empfängerorganismen im Rahmen gentechnischer Arbeiten benutzt, mit denen man gute Erfahrungen gemacht hat. Der Bakterienstamm E. coli K12 wird in Tabellen schulgeeigneter, nichtpathogener Mikroorganismen geführt und kann somit bedenkenlos für Schulexperimente verwendet werden (KULTUSMINISTERIUM NRW 1995, S. 63, Tabelle 4).
Bei Escherichia coli K12 DH5a handelt es sich lediglich um einen Abkömmling von E. coli K12, der in zusätzlichen Merkmalen genetisch verändert ist. Das K12-Derivat DH5a , wobei die Buchstaben DH auf den Erstbeschreiber hinweisen, hier DOUGLAS HANAHAN, gefolgt von einer Labornummer, ist nicht in der Lage, Laktose zu verwerten. Das liegt an einer Deletion im Genbereich, die für das laktosespaltende Enzym b -Galaktosidase codiert, wodurch dem Enzym am aminoterminalen Ende Aminosäuren fehlen und in einer inaktiven Form des Enzyms endet. Man kann nun mit Hilfe von bestimmten Plasmiden, auf denen dieses als a -Peptid bezeichnete aminoterminale Ende der b -Galaktosidase codiert ist, eine Rekonstitution der inaktiven Form der b -Galaktosidase erreichen (intragenische Komplementation). Dazu muß das Plasmid in die Bakterienzelle eingeschleust werden. Dort setzt dann u.a. die Proteinbiosynthese des auf dem Plasmid codierten a -Peptids ein. Dieses lagert sich mit dem enzymatisch inaktiven Teil, das auf dem Bakterienchromosom codiert ist, zusammen und das aktive, laktosespaltende Enzym darstellt. Dieser Vorgang wird als a -Komplementation bezeichnet. Auf speziellen Agarplatten, z.B. McConkey Agar, können diese Bakterien dann anhand einer typischen Färbung visuell identifiziert und von den nicht laktoseverwertenden unterschieden werden.

3.7.2 Plasmide

Plasmide sind ringförmig geschlossene, extrachromosomale, doppelsträngige DNA-Bereiche. Sie kommen hauptsächlich bei Prokaryonten und einigen wenigen eukaryotischen Mikroorganismen vor. Laut SCHLEGEL (1992) sind natürlich vorkommende Plasmide in einem Größenbereich von 2 - 1200 kb beschrieben worden. Plasmide können unabhängig vom Bakterienchromosom replizieren, ihre Kopienzahl in der Zelle ist ein spezifisches Merkmal des Plasmids. Die auf ihnen codierten Gene verschaffen den Zellen, die sie enthalten, unter bestimmten Umständen selektive Stoffwechselvorteile. Beispielsweise sind auf Plasmiden häufig Antibiotikaresistenzen codiert. Daneben gibt es aber auch Plasmide, die Gene für bestimmte Resistenzen gegenüber Schwermetallen, für die Synthese von Antibiotika oder für die Fähigkeit Stickstoff zu fixieren tragen. NEVERS (1991, S. 29) stellt die auf den Plasmiden codierten Eigenschaften als „natürliches Reservoir nützlicher genetischer Information dar, die im Notfall abgerufen werden kann". Es gibt aber auch Plasmide, sogenannte F-Plasmide, wobei das „F" für Fertilitätsfaktor steht, die den Transfer von Plasmid-DNA zwischen Bakterienzellen initiieren. Dabei wird Plasmid-DNA von der Bakterienzelle mit F-Plasmid, die Donor genannt wird, in eine als Rezipient bezeichnete Bakterienzelle, die kein F-Plasmid besitzt, übertragen. Dieser Vorgang wird Konjugation genannt. Plasmide spielen aber auch eine wichtige Rolle in der Gentechnik. Sie erfüllen dort die Funktion von Vektoren. Vektoren „dienen als Transportmittel („Genfähren") zur Übertragung von Fremd-DNA in Wirtszellen" (NEVERS 1991, S. 33). Diese Plasmid-Vektoren sind von natürlich vorkommenden Plasmiden abgeleitete, für ihre Verwendung als „Genfähre" optimierte Formen. Alle Plasmid-Vektoren zeichnen sich durch einige gemeinsame Strukturen aus. Sie besitzen für die Replikation einen Replikationsstartpunkt oder Replikationsursprung (origin of replication), der als Ansatzstelle für die an der Replikation beteiligten Enzyme dient. Weiterhin sind verschiedene Schnittstellen für Restriktionsenzyme und je nach Plasmid unterschiedliche Selektionsmarker, die der Wirtszelle gegenüber ihren Artgenossen Überlebensvorteile bieten und für den Verbleib des Plasmid-Vektors in der Wirtszelle wichtig sind, auf ihnen enthalten. Ferner sind Plasmid-Vektoren durch das Fehlen von Transfer-und Mobilisierungsgenen so konstruiert, daß eine natürliche Übertragbarkeit zwischen Bakterienzellen, wie bei der oben beschriebenen Konjugation, nicht oder als sehr unwahrscheinlich angesehen werden kann (vgl. auch Stellungnahme der ZKBS zur Mobilisierbarkeit des Plasmids pBR322 und dessen Derivate, Mai 1994, in: EBERBACH et al. 1996). Plasmid-Vektoren werden immer nach einem bestimmten System abgekürzt. Am Beispiel von pBR322 soll dieses erläutert werden. Das „p" steht für Plasmid, gefolgt von den Kürzeln der Konstrukteure, welche in diesem Fall F. BOLIVAR und R.L. RODRIGUES waren. Die Zahl am Ende weist auf die Nummer hin, unter der dieses Plasmid z.B. im Labor geführt wird.
In den Schülerexperimenten können unterschiedliche Plasmid-Vektoren verwendet werden, die alle als sicher anerkannt sind und mit denen in Forschungslaboratorien sowie in Schulexperimenten gute Erfahrungen gemacht wurden. Im folgenden sollen diese mit ihren wesentlichsten Eigenschaften kurz skizziert werden.

3.7.2.1 Plasmid-Vektor pBR322

pBR322 ist ein Vektorsystem, das aus drei unterschiedlichen, bei E. coli natürlich vorkommenden Teilen zusammengestellt wurde. Das 4,36 kb große Plasmid enthält neben dem Replikationsursprung sowie benachbarten Sequenzen des Plasmids pMB1 Gene, die für Antibiotikaresistenzen codieren. Dabei handelt es sich um das Tetrazyklinresistenzgen des natürlich vorkommenden Salmonella Plasmids pSC101 und das Ampicillinresistenzgen des Transposons Tn3. pBR322 liegt in der Zelle in einer Kopienzahl von 15 - 20 Plasmiden pro Zelle vor.

Abbildung 2: Plasmidkarte von pBR322 (aus: Agesen et al. 1991). (Als große Abbildung)

3.7.2.2 Plasmid-Vektor pUC19

pUC19 setzt sich aus Teilen des Plasmids pBR322 und des Bakteriophagen M13mp19 zusammen. Das 2,683 kb große Plasmid besitzt neben dem Replikationsursprung und dem Gen für Ampicillinresistenz auch Teile des lac-Operons von E. coli, worauf die Gene zur Verwertung von Laktose enthalten sind. pUC19 enthält davon die Sequenzen des Repressors, Promotors und Operators, aber auch den als a -Peptid benannten aminoterminalen Teil des für die b -Galaktosidase codierenden lacZ-Gens. pUC19 ist somit in E. coli-Zellen, die einen Defekt im aminoterminalen Bereich der b -Galaktosidase aufweisen, zur a -Komplementation fähig. Innerhalb des lacZ-Bereiches auf pUC19 befindet sich ein sogenannter Polylinker, auch „multiple cloning site" (MCS) genannt. Darunter versteht man einen Bereich, in dem vermehrt (hier: 10) Schnittstellen für unterschiedliche Restriktionsenzyme vorkommen. pUC19 ist ein „high copy plasmid", was in einer Anzahl von 500 - 700 Kopien in der Wirtszelle vorliegt.

3.7.2.3 Plasmid-Vektor pUC18

pUC18 ist äquivalent zu pUC19. Lediglich der Polylinker ist entgegengesetzt angeordnet, d.h., daß die Schnittstellen für die Restriktionsenzyme in dieser Region sich in genau umgekehrter Reihenfolge befinden.

Abbildung 3: Plasmidkarte pUC18 (aus: AGESEN et al. 1991). (Als große Abbildung)

3.7.2.4 Plasmid-Vektor pAMP

Das Plasmid pAMP ist ein in Cold Spring Habor (USA) speziell für Lehrzwecke konstruiertes Molekül. Es stellt ein Derivat des pUC19 Vektors dar, in dessen Polylinker ein 1904 bp großes DNA-Fragment des Phagen Lambda inseriert wurde. Es beinhaltet die von pUC19 stammenden Sequenzen des Replikationsursprungs und Ampicillinresistenzgens. Durch das Insert im Polylinker ist das lacZ-Gen zur intragenischen Komplementation nicht mehr fähig. In einer von MICKLOS/ FREYER (1990) publizierten Versuchsanleitung wird dieses Plasmid zu Lehrzwecken mit einem zweiten Plasmid kloniert. Bei dem zweiten Plasmid handelt es sich um das Plasmid pKAN, was ebenfalls ein Derivat von pUC19 darstellt, in dessen Polylinker das Antibiotikaresistenzgen für Kanamycin aus dem Plasmid pKC7 inseriert worden ist. pAMP und pKAN zeigen nach Restriktionsspaltung ein jeweils charakterisches Bandenmuster nach gelelektrophoretischer Auftrennung, wodurch sie von Schülern nach Angaben von MICKLOS/ FREYER (1990, S. 298) leicht zu unterscheiden sind. Das 4,539 kb große pAMP-Plasmid liegt in der Bakterienzelle in hoher Kopienzahl (500 - 700) vor, die der von pUC19 entspricht. Aus diesem Grund wurde es für das Schülerexperiment zur genetischen Transformation berücksichtigt und getestet.

Abbildung 4: Plasmidkarte pAMP mit Restriktionsstellen (aus: MICKLOS/ FREYER 1990). (Als große Abbildung)

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